大腸菌におけるFプラスミド転移と二重抗生物質選択

トランスファー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子に置き換わるFプラスミドを運ぶドナー大 腸菌 細胞から始めます。

これらの細胞には、欠落しているトランスファー遺伝子をコードするレスキュープラスミドも含まれています。

DNAに異なる抗生物質耐性遺伝子を持つレシピエント大 腸菌 細胞を同量採取します。

両方の培養物を抗生物質を含まない栄養培地に混合し、振らずにインキュベートします。

ドナー細菌のレスキュープラスミドはトランスファー遺伝子を発現し、ドナー細胞がF線毛を構築できるようにします。

線毛は2つの細胞の間に架け橋を形成し、ドナーからレシピエントへの一方向のプラスミド移動を可能にし、トランスコンジュガントを形成します。

混合物を渦状にして交尾ペアを妨害し、氷の上に置いてそれ以上の交尾を防ぎます。

トランスコンジュガント選択可能な抗生物質を含む寒天プレート上で培養物をスポットし、インキュベートします。

両方の抗生物質耐性遺伝子を保有するトランスコンジュガントは、両方の抗生物質の存在下で生存してコロニーを形成し、Fプラスミド導入の成功を確認します。

100マイクロリットルのドナー細胞と100マイクロリットルのレシピエント細胞を800マイクロリットルの滅菌LB培地に1ミリリットルの総容量で2回分注します。細胞を振らずに摂氏37度で1時間交尾させます。1時間後、細胞を30秒間渦巻きさせて、交尾ペアを破壊します。

次に、細胞を氷の上に10分間置いて、それ以上の交尾を防ぎます。

pOX38-Tcクロラムフェニコールノックアウトを保有するトランスコンジュガントMC4100細胞は、ストレプトマイシンとクロラムフェニコールを含む寒天プレートの各半分に各希釈液の10マイクロリットルのアリコートをスポットすることにより選択します。両方の重複した混合物について繰り返します。次に、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。