光活性化フラビンモノヌクレオチドを用いた細菌の不活化

まず、液体培地の入ったチューブに病原菌を接種します。

インキュベートして細菌の増殖を促進し、培養物を新しいチューブに移します。

細胞をペレットにスピンダウンし、上清を廃棄します。

細菌ペレットを、フラビンモノヌクレオチド(FMN)の濃度を高めた緩衝液、光増感剤、およびFMNを含まない緩衝液に再懸濁して、コントロールとして機能します。

チューブの内容物を完全に混合し、懸濁液をガラス管に移します。

チューブを可視光にさらしてFMNを光活性化し、FMNは酸素分子と反応して活性酸素種(ROS)を生成します。

ROSは細菌の細胞成分に損傷を与え、それによって細菌の生存率を低下させます。

サンプルのアリコートを固体培地に移し、均一に広げ、インキュベートして生き残った生存細菌がコロニーに成長できるようにします。

インキュベーション後、コロニーを定量化し、対照と比較した細菌生存率の減少率を計算して、FMNの用量依存効果を評価します。

黄色ブドウ球菌のコロニーを、15ミリリットルのスクリューキャップ付き試験管内の10ミリリットルの溶原性ブロスに接種します。シェーカーで摂氏37度で16時間培養します。0.5ミリリットルの培養物を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。

滅菌水を加えて、培養物を600ナノメートルで光学密度0.5に希釈します。次に、0.5ミリリットルの培養物を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。14,000 Gで10分間遠心分離し、上清をデカントします。

1ミリリットルのFMN緩衝液を細胞ペレットとボルテックスに加えます。照射制御の場合は、1ミリリットルのリン酸緩衝液を追加します。30マイクロモルFMNとリン酸緩衝液を含む1ミリリットルの細菌細胞溶液をガラス管に移します。

10ワット/平方メートルの紫色の光の下で30分間放射するためにそれらを配置します。次に、30、60、および120マイクロモルのFMNとリン酸緩衝液を含む1ミリリットルの細菌細胞溶液をガラス管に移します。120ワット/平方メートルで20分間ブルーライトを照射します。

また、1ミリリットルの120マイクロモルFMNを含むチューブを60分間照射します。照射後、0.2ミリリットルの反応液をルリア寒天プレートに加えます。L字型のガラス棒を使用して溶液を広げ、摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、黄色ブドウ球菌の生存プレート数と不活性化率を計算します。