活性酸素種生成による光誘起細菌不活化の定量化

電子供与体であるL-メチオニン、酸化還元指示薬であるニトロブルーテトラゾリウム(NBT)、光増感剤であるフラビンモノヌクレオチド(FMN)を含む緩衝反応混合物から始めます。

この混合物を細菌ペレットとボルテックスを含むチューブに加えます。

溶液をガラス管に移します。

次に、混合物に紫色の光を照射してFMNを活性化し、FMNはL-メチオニンからの電子を受け入れ、反応性中間体を形成します。

この中間体は電子を溶存分子状酸素に伝達し、細菌表面付近に活性酸素種またはROSを生成します。

結果として生じるROSは細胞成分に損傷を与え、細菌の生存率を低下させます。

ROSはまた、NBTを細菌表面近くに沈着する青色の生成物であるホルマザンに還元します。

混合物をチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄します。

ペレットを有機溶媒に再懸濁してホルマザンを可溶化します。

最後に、吸光度を測定して、ROS生成による光誘発性細菌の不活性化を決定します。

前述のように 黄色ブドウ球菌 サンプルを調製して、細胞ペレットを取得します。75ミリリットルのリン酸緩衝液に、0.1093グラムのL-メチオニン、0.1グラムのNBT、および25ミリリットルのFMN溶液を加えます。

FMN濃度の異なる各反応物溶液を1ミリリットルを細胞ペレットとボルテックスに加えます。10ワット/平方メートルの紫色の光の下で溶液を10分間照射します。混合物を14,000 Gで10分間遠心分離し、上清をデカントします。

ペレットを1ミリリットルのジメチルスルホキシドに再懸濁して、還元されたNBTを抽出します。560ナノメートルで吸光度を記録します。