負イオン交換クロマトグラフィーによる細菌タンパク質の選択的精製

選択的タンパク質結合のために正に帯電した官能基を含むイオン交換樹脂溶液から始めます。

次に、病原菌ヘ リコバクターピロリの病原性因子を過剰発現するように操作された宿主細菌細胞から得られたタンパク質抽出物を取ります。

抽出物には、pH 8の緩衝液中に宿主細胞タンパク質とともに標的病原性因子が含まれています。

タンパク質抽出物を樹脂と混合し、攪拌しながらインキュベートして、タンパク質と樹脂の均一な相互作用を確保します。

バッファーpHよりも低い等電点を持つ宿主タンパク質は、負に帯電し、正に帯電した樹脂に結合します。

等電点がバッファーpHに近い標的タンパク質は、ほとんど荷電していないままであり、結合していないままです。

タンパク質-樹脂スラリーをクロマトグラフィーカラムに移し、樹脂を沈降させます。

結合していない標的タンパク質を含む液相を収集します。

レジンをバッファーですすぎ、ターゲットタンパク質の回収率を最大限に高めます。

15ミリリットルのDEAE樹脂を調製するには、0.6グラムのDEAE樹脂乾燥粉末を30ミリリットルのTris-HClバッファーに室温で少なくとも1日懸濁します。

樹脂を10,000倍g、摂氏4度で1分間遠心分離し、上清を除去して廃棄します。次に、15ミリリットルのTris-HClバッファーを追加します。遠心分離、再懸濁ステップをさらに4回繰り返した後、15ミリリットルの沈降した樹脂を摂氏4度で保存して、その後の使用に備えます。

摂氏4度で作業し、調製した可溶性タンパク質45ミリリットルを15ミリリットルの樹脂に加え、撹拌バー付きの100ミリリットルのビーカーに移します。摂氏4度の撹拌板を使用してプロテイン樹脂スラリーを1時間撹拌します。次に、プロテイン樹脂スラリーを活栓を取り付けたプラスチックまたはガラスの柱に注ぎ、重力下で樹脂を沈降させます。

活栓を開き、カラム内の液面が樹脂のすぐ上になるまで、タンパク質溶液が重力流によってカラム内を通過できるようにします。精製された好中球活性化タンパク質を含む結合していない画分としてフローを収集します。15 ミリリットルの氷冷した Tris-HCl バッファーをカラムに加えます。

活栓をもう一度開いて、カラム内の液面が樹脂のすぐ上になるまで、洗浄バッファーが重力流によってカラム内を通過できるようにします。流れを洗浄率として収集します。氷冷バッファーでさらに4回洗浄を繰り返して、追加の洗浄画分を収集します。