Streptococcus mutansからのポリヒスチジンタグ付きタンパク質の精製手順

培地に分泌されたポリヒスチジンタグ付きタンパク質を発現するスト レプトコッカスミュータン スの培養を取ります。

培養物を遠心分離し、タンパク質が豊富な上清を収集します。

硫酸アンモニウムを加え、攪拌しながらインキュベートし、溶解度を下げてタンパク質を沈殿させます。

溶液をチューブに移し、遠心分離し、上清を廃棄します。

タンパク質を安定化するために、塩と低イミダゾールを含む結合バッファーにペレットを再懸濁します。

溶液を新鮮な結合バッファーに対して透析して、余分な塩を除去します。

透析溶液を遠心分離して不溶性破片をペレット化し、上清をろ過します。

濾液をニッケルを帯電したアフィニティー樹脂と混合し、インキュベートして、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質をニッケルイオンに選択的に結合させます。

混合物をクロマトグラフィーカラムにロードし、結合バッファーで洗浄して、結合していないタンパク質を除去します。

次に、イミダゾールを多く含む溶出バッファーを添加して、ニッケルイオンからヒスチジンを置換し、ポリヒスチジンタグ付きタンパク質を放出します。

精製されたタンパク質を含むこの溶出液を収集します。

細菌培養懸濁液を摂氏4度で10,000倍gで20分間遠心分離します。

培養上清を3リットルのガラスビーカーに移します。培養上清からタンパク質を濃縮するには、2リットルの上清をマグネチックスターラーに置き、激しく攪拌を開始します。1,122グラムの硫酸アンモニウムを加え、摂氏4度で4時間または一晩激しく撹拌しながら沈殿物を形成します。

次に、硫酸アンモニウム沈殿溶液を15,000倍gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清をデカントします。へらで沈殿物を集め、200ミリリットルのガラスビーカーに移します。

ペレットを35ミリリットルの結合バッファーに再懸濁します。次に、それぞれ約25ミリリットルの懸濁液を再生セルロース透析チューブに移します。透析チューブを摂氏4度の撹拌器上の2.5リットルの撹拌結合バッファーに入れて、懸濁液を透析します。

2時間後に透析液を交換し、一晩透析を続けます。次に、透析懸濁液をチューブから遠心分離管に移し、チューブを20,000倍gの遠心分離機に摂氏4度で10分間置きます。吸引ろ過装置を使用して、上清を0.2マイクロメートルのメンブレンフィルターに注ぎ、ろ過します。

濾液を75ミリリットルのフラスコに移します。

濾過懸濁液からポリヒスチジンタグ付きgtfSIを分画するには、まず固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを調製します。原稿に従って樹脂を平衡化させた後、ホフマンピンチコックを閉じます。

ろ過した懸濁液5ミリリットルをカラムに加えてスラリーを作ります。次に、すべてのスラリーを残りのろ過懸濁液に移し、混合物を摂氏4度で30分間穏やかに旋回させます。混合物をカラムに戻します。

ホフマンピンチコックを開き、重力流によってサスペンションを取り外します。IMAC樹脂を20ミリリットルの結合バッファーで洗浄し、次に20ミリリットルの溶出バッファーを溶出して組換えgtfSIを取得します。