可変数タンデムリピート(VNTR)解析による魚類病原体の検出

まずホルマミド系変性溶液を含むPCRプレートから始めます。

魚の病原性細菌由来の希釈PCR増幅細胞を各ウェルに加えます。

これらのアンプリコンには蛍光標識された可変数タンデムリピート(VNTR)が含まれており、細菌同定のための遺伝的マーカーとして短く繰り返し配列されています。

空気の泡を除去するためにプレートと遠心分離機を密閉してください。

プレートを熱サイクラーで加熱し、二本鎖VNTRを変性させます。

ホルマミドは鎖分離を促進し、再焼きなましを抑制します。

プレートを急冷して一本鎖DNAを安定化させる。

遠心分離機でサンプルの体積を採取します。

シールを外し、プレートをフレームで固定します。

毛細管を挿入し、毛細管電気泳動を行います。

電気泳動中、VNTR断片は電場の下で毛細管内を移動し、サイズごとに分離されます。

レーザーが各断片の蛍光タグを励起し、色分けされた信号を生成します。

その結果得られた電気泳動図は、病原性細菌に対応するVNTRピークパターンを示します。

PCR増幅細胞の確認後、新しいPCRストリップまたはプレートを用いて、精製水でPCR産物1から10を希釈します。ボルテックスと遠心分離機の短時間。煙槽内で作業中は、ホルマミドと基準サイズの標準溶液からなる遠心分離機管でマスターミックスを準備します。

分析するPCR産物の数に応じて、原稿に記載された試薬体積を使用します。10%余剰の量を許容してください。短時間渦を巻き、利用可能な毛細管電気泳動系に適したPCRプレート上で9.5マイクロリットルを個々のウェルに分散させます。

次に、薄めたPCR産物を0.5マイクロリットル加えます。封閉して遠心分離機を短時間で行います。その後、サンプルを含むプレートをPCRサーモサイクラーに詰め、95度Cで3分間変性させ、その後4度まで無限に冷却します。

1000gで1分間遠心分離し、慎重にシールを外し、メーカーの指示に従って校正済みの毛細電気泳動システムにプレートを載せます。選定装置に適した試薬を用いた断片分析(キャピラリー電気泳動)を実行し、原稿の説明に従って実行条件を調整します。