プソドモナスシリンガにおけるバクテロオシン媒介殺死検出のためのソフトアガーオーバーレイアッセイ

まずは温かい温度で保温した溶けた柔らかい寒天から始めます。

試験株である Pseudomonasシリンガ 菌を寒天に接種します。

その後、細胞を均等に分散させるために短時間の渦を起こします。

混合物を固まった寒天プレートに注ぎ、均等に広げます。

蓋を閉めて固まるのを待ちます。

硬化した寒天の表面にろ過された上清液を見つけてください。

上清液には、ストレス誘発ドナーの P. syringae 株から由来する抗菌分子であるバクテリオシンが含まれています。

培養皿を培養して、細菌の増殖とバクテロオシンの寒天内への拡散を可能にします。

バクテリオシンは試験株の特定の表面受容体に結合し、その膜を破壊して細胞死を引き起こします。

これにより、寒天にクリアゾーンが形成され、テスト株が抗菌分子であるバクテリオシンによって殺菌された領域を示します。

培養液を1から100で新しいKBに希釈します。培養液を室温で振って3〜4時間培養します。次に、超純水で寒天の懸液をオートクレート滅菌して滅菌した水寒天を準備します。

使用前に、溶けた軟質寒天を60度の水浴で保温してください。滅菌血清学ピペットを用いて、3ミリリットルの軟質寒天を無菌培養チューブに移します。培養チューブを水浴に戻し、溶融状態に保ちます。

オーバーレイを注ぐ前に、溶融寒天を冷ませつつ固まらせないようにしてください。

接種前に寒天を高温で完全に溶融した状態に保つことが非常に重要です。そうでなければ、オーバーレイはざらついた見た目になり、読みにくいです。

滅菌フード内で、100マイクロリットルのテスター株培養を軟らかい寒天とボルテックスに接種し、混合します。培菌を手で10〜15秒回転させてから寒天プレートの底に注ぎます。プレートをあらゆる方向に傾けて、柔らかい寒天が底の寒天を均等に覆うようにします。

皿に蓋をして20〜30分固まらせます。固まる際にプレートを乱さないように注意してください。固まったら、上澄液を2〜5マイクロリットルの上層液を上層に塗り付けます。

プレートは室温で一晩培養します。翌朝、結果を観察し記録してください。この方法を用いると、P . syringae の2株が異なるバクテリオシンによって阻害されます。株Aは高分子量のバクテリオシン(テイロシン)には感受性ですが、代替の低分子量バクテロオシンには感受性がありません。