S. aureusの代謝物を分析するための液体クロマトグラフィー–質量分析法に基づくアプローチ

まずはシリカビーズを含む焼光液に懸浮させ、代謝状態を保つために低温で保存した黄色 ブドウ 球菌から始めます。

細菌を低温条件下で均質化し、細胞内内容物を放出しつつ代謝物の酵素分解を最小限に抑えます。

分解液を遠心分離し、代謝物豊富な上清液を採取します。

抽出物に有機溶媒を加え、渦を巻いて可溶性代謝物から高分子を沈殿させます。

遠心分離機で沈殿液をペレットし、上清液をバイアルに移します。

バイアルを液体クロマトグラフィー質量分析システムに積み込みます。

クロマトグラフィーカラム内部では、代謝物が化学的性質に基づいて固体の固定相と相互作用します。

代謝物を溶出するためにバッファーを入れます。次に、代謝物を質量分析計のエレクトロスプレーイオン化源に導き、イオン化します。

イオンは質量対電荷比に基づいて分離されます。

得られたデータは参照データベースと比較され、代謝物を特定します。

代謝物抽出を始めるには、まずサンプルを湿った氷で解凍します。その後、ホモジナイザーで6000rpmで30秒間の4回のバーストを行い、サイクル間にはドライアイスで2分間冷却します。

溶解液を、事前に冷蔵された冷蔵マイクロ遠心分離機チューブで最大速度で15分間清製します。遠心分離後、上清液をきれいなマイクロ遠心分離機チューブに移します。マイクロピペットを用いて、サンプルの一部をマイクロ遠心分離機チューブに移し、テキストプロトコルに記載された残留ペプチド含有量を定量します。

残りのサンプルはマイナス80度の温度で保存してください。液体クロマトグラフィーおよび質量分析による代謝物の分析については、テキストプロトコルを参照してください。