細胞内細菌群集を含むマウス膀胱上皮細胞の単離

まず、蛍光標識された尿路病原性 大腸菌に感染したマウスの膀胱上皮細胞から抽出します。

感染中、これらの細菌は上皮細胞に侵入し、宿主の免疫防御から守るバイオフィルム状の構造である細胞内細菌群集(IBC)を形成します。

解剖顕微鏡下で、IBCは個々の上皮細胞内に閉じ込められた大きな蛍光集合体として識別します。

抽出したガラス毛細血管を吸引ピペットに接続して、IBCを含む上皮細胞を単独で分離する口腔マイクロピペッティング装置を組み立てます。

毛細管の先端をPBSに短く浸し、毛細管による液体の取り込みを減らします。

毛細血管を選択した蛍光上皮細胞の近くに位置させ、優しい吸引でIBCを含む単一の細胞を引き込みます。感染していない細胞や細胞外細菌を避けます。

細胞を無菌のマイクロ遠心分離機チューブに、わずかな正圧で排出し、細菌の生存力を保つ。

この方法は、IBCを保持する上皮細胞を単一細胞解析のために分離することを可能にします。

すべてのセルが削り取られたら、引き抜いたガラス毛細管の抜き端を吸引管のゴムプラグに挿入し、1ミリリットルのピペット先端の細い端を管のもう一方の開口端にしっかりと押し込みます。

2ミリリットルの吸引ピペットの細い端を1ミリリットルのピペット先端の広い端にぴったりと押し込み、スクレイプした細胞懸濁液を解剖顕微鏡の下に置きます。20倍から40倍の倍率でIBCを大きな蛍光集合体として識別し、細かい端を新しいPBSチューブに1秒浸して毛細管作用による不要な体積の取り込みを減らします。

目的のIBCが見つかったら、毛細管の開口端をゆっくりIBCに近づけ、吸引ピペットに非常に微細な吸引力を加えてIBCをガラス毛細血管内に誘導します。次に、毛細管を空の1.5ミリリットル遠心分離機管に移し、わずかな正圧をかけて液滴とIBCをチューブ内に排出します。