JoVE 実験百科事典
Biological Techniques
0 回視聴 • 3:40 分 • July 8th, 2025
バキュロウイルス(二本鎖DNAウイルス)は、GP64などの主要なウイルス糖タンパク質を含むエンベロープに囲まれています。
細胞破片や汚染タンパク質を含む細胞培養上清からバキュロウイルスを単離するには、架橋アガロースビーズのマトリックスを含むヘパリンアフィニティークロマトグラフィーカラムを組み立てます。これらのビーズは、ヘパリン鎖に負の電荷を与える硫酸基を持つ直鎖状多糖類であるヘパリンに結合しています。
中性pHと最適なイオン強度を持つ洗浄バッファーでカラムを平衡化し、上清ローディング中のバキュロウイルスとヘパリンの相互作用を最大化するための好ましい条件を提供します。バキュロウイルス含有上清をカラムにロードします。
バキュロウイルスGP64の塩基性アミノ酸は、負に帯電したヘパリンとの非特異的な静電相互作用を促進し、緩く結合する汚染物質とは異なり、カラムにしっかりと結合します。カラムを洗浄バッファーですすぎ、結合していない汚染タンパク質や破片を除去します。
洗浄バッファーよりもイオン強度の高い溶出バッファーをカラムに通します。イオン強度が高いほど、バキュロウイルスとヘパリンの静電相互作用が破壊され、バキュロウイルスがカラムから解離して溶出します。
バキュロウイルス含有溶出液をフロースルーに回収します。バキュロウイルス懸濁液を生理学的塩濃度を含む緩衝液で直ちに希釈し、ウイルスの不活化を防ぎます。単離されたバキュロウイルスは、さらなる分析に使用できます。
入口ポート A1 からの洗浄バッファーラインを、少なくとも 500 ミリリットルの洗浄バッファーを含むボトルに入れて、クロマトグラフィーシステムをセットアップします。溶出バッファーのロードには、A2 バッファーのインレットポートを使用します。
フラクションコレクターに50ミリリットルのコニカルチューブを数本挿入して、カラムパススルーバキュロウイルス上清、洗浄バッファー、および溶出したバキュロウイルスを回収します。ヘパリンカラムを 5 つの 7.9 ミリリットルカラム容量の洗浄バッファーで、毎分 7 ミリリットルの線形流速で平衡化します。
入口サンプルポートのサンプルポンプを使用して、毎分2ミリリットルの線形流量で250ミリリットルのバキュロウイルス上清をヘパリンカラムにロードします。次に、紫外線吸光度曲線がベースラインに戻って安定するまで、10カラム容量の洗浄バッファーを毎分2ミリリットルの線形流速でヘパリンカラムに通します。
ヘパリンカラムからのバキュロウイルス粒子を、毎分4ミリリットルの線形流速で5カラム容量の溶出バッファーで希釈します。バキュロウイルス粒子がヘパリンカラムから解離するときのクロマトグラム上のタンパク質の急激な溶出ピークに注意してください。
溶出後、溶出したバキュロウイルス上清を20ミリモルのリン酸ナトリウムバッファーを使用して直ちに10倍に希釈し、その後の遠心分離中の浸透圧ショックによるバキュロウイルス粒子の不活性化を防ぎます。