親水性相互作用液体クロマトグラフィー:親水性ビーズを用いた親水性極性分析種を分離する技術

親水性相互作用液体クロマトグラフィー(HILIC)は、親水性極性化合物を極性度に基づいて分離する技術です。まず、極性官能基を運ぶ親水性ビーズを充填したHILICカラムをセットアップします。

まず、平衡バッファーと移動相(有機溶媒と水の混合物)を使用してカラムをコンディショニングします。緩衝分子はpHを安定させ、有機溶媒はカラムを飽和させます。水分子は固定化され、親水性ビーズの上に水層を形成します。

蛍光タグで標識された糖鎖(親水性極性化合物)の混合物を含むサンプルをロードします。移動相勾配を使用して、最適な流速でカラムを通します。

サンプルが疎水性移動相に沿って移動すると、糖鎖は水層に移動し、不純物が残ります。その後、糖鎖はビーズ上の極性官能基に向かって移動します。ここでは、極性の糖鎖が多いほど強く結合し、極性の低い糖鎖は緩く結合します。

移動相の疎水性が低下すると、極性が低く、保持時間が短い弱結合糖鎖が最初に溶出します。逆に、極性が高く、保持時間が長い強結合糖鎖は溶出が長続きします。

最後に、検出器は、クロマトグラムの標準糖鎖ピークに対応する溶出画分の蛍光シグナルを検出します。

まず、ソフトウェアを開いて移動相を制御します。UPLC 装置を 50% 溶媒 B および 50% 溶媒 C で 0.2 ミリリットル/分の流速で 30 分間洗浄します。次に、25%溶媒Aと75%溶媒Bで毎分0.2ミリリットルの流量で20分間洗浄し、次に毎分0.4ミリリットルの流量で洗浄します。

標識されたN型糖鎖を、100%アセトニトリルと超純水の混合物25マイクロリットルで2:1(体積/体積)比で溶解します。次に、摂氏 4 度で 134 x g で 5 分間遠心分離し、ドライブパイプを使用して 10 マイクロリットルの上清を UPLC 装置にロードします。

標識されたN-糖鎖を毎分0.4ミリリットルの流速で、75%〜62%のアセトニトリルの線形勾配で25分間分離します。次に、摂氏 60 度の UPLC 上でデキストランキャリブレーションラダー/グリコペプチドカラムによる分析実行を実行します。

励起波長と発光波長がそれぞれ330ナノメートルと420ナノメートルのN-グリカン

蛍光を検出します。