Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis:無傷のミトコンドリア呼吸鎖複合体の分析のための非変性分離技術

無傷のサブユニットを持つ呼吸鎖の5つのミトコンドリア複合体を分析するには、マイルドな非イオン性界面活性剤に可溶化したミトコンドリア複合体を取得します。陰イオン性色素であるクマシーブルー-Gを含むバッファーと混合します。

クマシーは洗剤に取って代わり、複合体に非特異的に結合し、負電荷を与えて青く染色します。さらに、クマシーは複合体の凝集を防ぎ、複合体の本来の構造と機能を維持するのに役立ちます。

電気泳動タンクで、長さに沿って細孔径が小さくなる勾配分解ゲルで構成され、大きな細孔径のスタッキングゲルを重ねたゲルカセットを組み立てます。アノードチャンバーとカソードチャンバーに、冷却されたアノードとクーマシー含有カソードバッファーを入れます。

クマシー結合タンパク質複合体混合物をウェルにロードします。電気泳動を開始します。

負に帯電したタンパク質複合体は、スタッキングゲルから勾配分解ゲルに、正に帯電したアノードに向かって移動します。小さな錯体は細孔を急速に通過しますが、大きな錯体は、分離ゲルを下るにつれて、狭孔サイズが制限されるため速度が低下します。

実行中に複合体から解離したクマシーは、正極緩衝液中のクマシーで置換され、複合体がゲル内のそれぞれの位置から移動するのを防ぎます。電気泳動後、ゲルを視覚化します。ミトコンドリア複合体は、サイズに応じて分解された青いバンドとして現れます。

分子量が最も低い複合体IIがゲル上の最下位を占め、次に複合体IV、III、およびVが続きます。分子量が最も高い複合体Iが最上位を占めます。

青色のネイティブゲル電気泳動を行うには、まず、青色陰極バッファーをゲルカセットに加えます。ピペットを使用してウェルを洗浄し、青色陰極バッファーで満たします。次に、5〜30マイクログラムのタンパク質サンプルをウェルにロードします。ゲルカセットを青色の陰極バッファーで上部まで静かに満たし、タンクにアノードバッファーを

充填します。

まず、ゲルを40ボルトの定電圧で15分間作動させます。次に、電圧を80ボルトに上げます。染料がゲルの長さの2/3に達するまでゲルを流します。青色の陰極バッファーを陰極バッファーに交換し、色素フロントがゲルから落ちるまで電気泳動を続けます。