JoVE 実験百科事典
Biological Techniques
0 回視聴 • 3:52 分 • July 8th, 2025
リアルタイム細胞分析(RTCA)を使用して細胞挙動を連続的に測定するには、ウェル底部に埋め込まれたインピーダンス測定金微小電極アレイを含むRTCAマイクロタイタープレートを入手します。細胞培養培地をウェルに注意深く加えます。
導電性媒体内で、微小電極全体に弱い電位を印加します。この電位により微小電極間に電流が流れ、ベースラインインピーダンス(媒体固有の電気抵抗)の測定が容易になります。
所望の濃度の哺乳類細胞懸濁液を培地含有ウェルにピペットで移動します。細胞がウェル内に均一に分布するようにします。
インキュベーション中、細胞はウェルの底に付着します。微小電極上の付着セルは絶縁体として機能し、電流の流れを制限し、インピーダンスを増加させます。
徐々に、細胞は微小電極上で増殖し、指数関数的なインピーダンスの増加につながります。
コンフルエント細胞層の形成後、細胞は栄養不足に遭遇し、死を迎えます。その結果、セルが微小電極から剥離し、インピーダンスが低下します。
連続インピーダンス測定により、細胞増殖や死などの細胞イベントのリアルタイムモニタリングが容易になります。
細胞感染に適した細胞量を決定するには、実証されているように、PBSで細胞を洗浄する前に、24時間、約80%コンフルエントMDCK細胞培養物を調製し、37°Cでフラスコあたり3ミリリットルの0.25%トリプシン-EDTAで45分間インキュベーションして回収します。
細胞が剥離したら、フラスコあたり7ミリリットルの新鮮な培地で反応を停止し、各培養物の細胞をカウントします。細胞を細胞培養培地1ミリリットルあたり4 x 105細胞に希釈し、指示に従って細胞の2倍の連続希釈を行います。
Eプレートの電極に触れずに、100マイクロリットルの細胞培養培地を各ウェルに加える前に、Eプレートを室温で数分間置きます。クレードルのロックを解除し、プレートの前端をインピーダンス測定器のクレードルポケットに挿入します。インキュベーターのドアを閉め、ソフトウェアを開きます。
[デフォルトの実験パターン設定]で、選択したクレードルをハイライト表示し、トップページをダブルクリックして実験の名前を入力します。「レイアウト」をクリックし、プレートの選択した各ウェルに必要なサンプル情報を入力します。「スケジュール」|「ステップ」|、「ステップの追加」をクリックします。ソフトウェアは、バックグラウンドインピーダンスを測定するための1秒のステップを自動的に追加します。
「実行」と「開始/続行」をクリックします。「プロット」と「追加」をクリックして適切なウェルを選択し、バックグラウンドインピーダンスが負の0.1から0.1の間にあることを確認してから、次のステップに進
みます。次に、クレードルからプレートを取り外し、各細胞懸濁液100マイクロリットルを適切なウェルに2回加えます。Eプレートをクレードルポケットにロードする前に、Eプレートを室温で30分間層流フードに入れて、細胞がウェルの底に均一に分布するようにします。「スケジュール」と「ステップの追加」をクリックし、値を入力してセルを 30 分ごとに 200 回繰り返して監視してから、「開始/続行」を選択します。
細胞インピーダンスデータを確認・プロットするには、「プロット」をクリックし、播種後24時間の定常期直前の細胞濃度を選択し、ウイルス感染時にまだ成長期にある細胞を取得します。