JoVE 実験百科事典
Immunology
0 回視聴 • 3:06 分 • July 8th, 2025
初代マクロファージの培養物を含むプレートから始めます。
マクロファージ上のトール様受容体に結合する細菌リポ多糖類LPSを導入し、タンパク質NLRファミリーピリンドメイン含有3またはNLRP3のアップレギュレーションを引き起こします。
カリウムイオンの流出を媒介するイオノフォアを追加します。細胞質ゾルカリウムの減少はNLRP3を活性化する活性化されたNLRP3は、オリゴマー化してアダプタータンパク質の動員を誘導し、アダプタータンパク質はプロカスパーゼ-1を動員してインフラマソームを形成します。
自己タンパク質分解は、プロカスパーゼ-1を活性カスパーゼ-1に変換し、炎症性細胞死またはパイロトーシスを媒介します。パイロトーシス中のDNA損傷は核凝縮を引き起こします。
細胞を固定し、洗剤で処理して透過性化します。
インフラマソーム関連アダプタータンパク質に結合する一次抗体と、一次抗体に結合してインフラマソームを標識する蛍光標識二次抗体を追加します。
蛍光核酸染色を導入して核を標識します。蛍光顕微鏡下では、細胞は凝縮した核(パイロトーシスを示す)とアダプタータンパク質の病巣(インフラマソーム形成を示す)を示します。
ニゲリシン処理細胞の免疫蛍光化学分析では、プローブ標識細胞を洗浄し、ウェルあたり250マイクロリットルの固定および透過処理溶液で細胞を光から保護した氷上で30分間インキュベートします。
マクロファージを新鮮な洗浄バッファーでさらに3回洗浄し、C末端カスパーゼリクルートメントドメイン(ASC)を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質に対する250マイクロリットルの一次抗体で細胞を氷上で1時間標識します。
インキュベーションの最後に細胞を洗浄し、250マイクロリットルの適切な蛍光色素結合二次抗体でサンプルを氷上でさらに1時間標識し、最後の5分間に4マイクロリットルの適切な蛍光核染色色素を加えます。
細胞をコールドウォッシュバッファーで3回洗浄した後、示されているように7マイクロリットルの色あせ防止封入剤でカバーガラスをスライドにマウントし、蛍光共焦点顕微鏡でマクロファージを画像化します。