フローサイトメトリーを用いた細菌表面へのビトロネクチン結合の検出

イン

フルエンザ菌の野生型および変異株、f型を含むフローサイトメーターチューブを取ります。

ブロッキングタンパク質とビトロネクチンを含むバッファーをピペットで移動します。インキュベート。

ブロッキングタンパク質は細菌表面の非特異的相互作用を減少させますが、ビトロネクチン分子は野生型細菌表面のビトロネクチン結合タンパク質であるプロテインHに結合します。変異株では、プロテインHがないため、ビトロネクチンは結合しません。

遠心機。結合していないビトロネクチンとブロッキングタンパク質を除去します。

野生型細菌表面に結合したビトロネクチンに特異的に結合する一次抗ビトロネクチン抗体を含むバッファーを追加します。

次に、ビトロネクチンの一次抗体に結合し、ビトロネクチンの検出を促進する蛍光色素結合二次抗体を導入します。

遠心機。結合していない二次抗体を除去します。バクテリアをバッファーに再懸濁します。

フローサイトメトリーを実行して、細菌表面へのビトロネクチン結合を決定します。

野生型株と変異株の蛍光シグナルを比較します。野生型細菌の蛍光シグナルのシフトは、ビトロネクチンが細菌表面に結合していることを確認します。

フローサイトメトリーの準備をするには、細菌ペレットを250ナノモルのビトロネクチンを含む50マイクロリットルのブロッキングバッファーで再懸濁します。次に、サンプルを振とうことなく室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、3,500 x g で5分間遠心分離して細菌をペレット化します。次に、PBSおよび同様の遠心分離ステップを使用してペレットを3回洗浄します。

洗浄後、50マイクロリットルの初代ヒツジ抗ヒトビトロネクチンポリクローナル抗体をPBS / BSAで1〜100希釈して細菌ペレットに加えます。懸濁液を室温で1時間インキュベートします。次に、細菌をPBSで3回洗浄して、結合していない抗体を除去します。

次に、フルオレセインイソチオシアネート結合ロバ抗ヒツジポリクローナル抗体を含むPBS/BSAを50マイクロリットルをペレットに加えます。暗所で室温で1時間インキュベートします。最後に、3つの洗浄ステップの後、細菌ペレットを300マイクロリットルのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリーで分析します。