細菌感染トランスジェニックゼブラフィッシュにおける光変換に基づく白血球追跡

白血

球(食作用免疫細胞)で光変換性蛍光タンパク質を発現するアガロース包埋麻酔トランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫を含む皿から始めます。

赤色蛍光色素標識細菌が事前に注入された左耳小胞は、皿の底に対して平らに配置されます。

耳小胞内では、事前に注射された細菌が局所感染を引き起こし、免疫細胞の遊走とケモカイン放出を引き起こし、耳小胞への白血球浸潤を引き起こします。

蛍光顕微鏡下で、感染部位の白血球による緑色白血球の初期動員と赤色細菌の食

作用を観察します。

405ナノメートルの波長で耳小胞を照らし、光変換蛍光タンパク質を緑色から赤色に不可逆的に変換し、白血球に赤色蛍光を与え、白血球の明確な視覚化と正確な追跡を可能にします。

次に、幼虫をさまざまな深さの2つの異なる波長で調べ、光変換された赤色と残りの緑色の両方の蛍光白血球を視覚化できるようにします。

光変換された赤白血球は耳小胞から分散して体全体に散乱し、光変換ベースの白血球追跡を促進します。

実体顕微鏡のステージ上のテキストプロトコルに従ってトリカインを含むアガロースを調製した後、トランスファーピペットを使用して、4〜5匹の麻酔した幼虫をガラス底皿に入れます。トリカインとアガロース溶液を摂氏55度の水浴から取り出し、室温で1〜2分間冷まします。

そ

の間に、麻酔をかけた幼虫からできるだけ多くの液体を取り除きます。次に、表面の約半分が覆われるまで、冷やしたアガロースを皿に注ぎます。次に、皿を回転させてアガロースを広げます。皿の側面に浮かんだ幼虫を拾い上げ、ピペットで中央に戻します。次に、実体顕微鏡下で、長いピペットチップを使用して、必要に応じて幼虫をそっと配置します。

耳小胞をイメージングするには、右耳小胞が上を向き、左耳小胞が皿の底に対して平らになるように幼虫を配置します。皿を動かす前に、アガロースを約10分間冷まします。次に、アガロース層の上にトリカインとE3溶液をそっとピペットで入れて、湿らせた状態を保ちます。

サンプルを視覚化するには、488 ナノメートルと 543 ナノメートルのレーザーを使用した Z スタック スキャンを使用します。連続ラインスキャンを使用して、レーザー出力と検出器ゲインを調整します。誤って光変換された赤色蛍光がないことを確認します。「画像取得制御」ウィンドウの「刺激設定」で、「スキャナーの使用」ツールを選択し、「メイン」を選択します。405ナノメートルレーザーを選択し、出力70%に設定します。次に、円オプションを使用して、耳小胞の関心領域を定義します。

「刺激開始設定」で、事前発動が1フレーム、発動時間が60,000ミリ秒の「連続発動」を選択します。「取得設定」ウィンドウの「タイムスキャン」見出しで、2つの分間隔(それぞれが写真変換前用と写真変換後用)を選択します。タイムラプスシリーズを開始して、定義された関心領域のフォトコンバージョンを開始します。最後に、Zスタックと488ナノメートルおよび543ナノメートルのレーザーを使用してサンプルをスキャンし、光変換された赤色蛍光と残りの緑色蛍光を視覚化します。