ヒト脳オルガノイドを作製するためのIn Vitro法

神経

上皮前駆細胞の自由浮遊クラスターである神経球の培養から始めます。

これらの神経球を埋め込みシートに移します。

メディアを取り外します。タンパク質と成長因子を含む細胞外膜マトリックスを各神経圏に一滴加えます。

マトリックスが固化するまでインキュベートし、その中に神経球を埋め込みます。

次に、ニューロスフィア培地を使用してマトリックスに埋め込まれたニューロスフィアをニューロスフィア培地を含む培養プレートに移します。

インキュベート。細胞外膜マトリックスとその成分は、神経上皮前駆細胞が増殖して液体で満たされた内腔を形成する神経上皮細胞への分化を促進します。

インキュベーション後、神経球を予熱した脳オルガノイド培地を含むスピナーフラスコに移します。攪拌しながらインキュベートすると、酸素と栄養素の拡散が促進され、細胞の成長が促進されます。

培地中の成長因子と低分子阻害剤は神経分化を促進し、特定の脳領域の細胞に発達し、成熟した脳オルガノイドを形成します。

この手順を開始するには、滅菌ハサミで事前に切断した200ミリメートルの先端を使用して、200マイクロリットルのマイクロピペットで神経球を収集します。次に、神経球を互いに約5ミリメートル離してパラフィンフィルムの上に置き、100ミリメートルの皿に入れ、残りの培地をできるだけ慎重に取り除きます。次に、EHSマトリックスを各神経球に一滴加えます。

EHSマトリックス滴を神経球とともに摂氏37度で15分間インキュベートします。その後、神経球を神経球培地で洗い流して、パラフィンフィルムから神経球を注意深く洗い流します。その後、神経球を次の4日間インキュベートし、2日目に2ミリリットルの新鮮な神経球培地を加えます。

この手順では、100ミリリットルの脳オルガノイド培地を各スピナーフラスコにサイドアームを通して加え、インキュベーター内で培地を摂氏37度で少なくとも20分間予熱します。次に、神経球がすべて分離されていることを確認します。EHSマトリックスで2つ以上接続されている場合は、接続マトリックスをメスで切って分離する。

25 RPMで撹拌プログラムを設定します。EHSマトリックスに埋め込まれた神経球を、100ミリリットルのオルガノイド培地を含むスピナーフラスコに慎重に移します。その後、スピナーフラスコをインキュベーター内の磁気攪拌プラットフォームに摂氏37度で14日間置きます。これはオルガノイド培養のゼロ日目です。培地の半分を取り除き、同量の新鮮な培地を加えることで、週に一度培地を交換します。