微小電極アレイに結合した3次元神経回路網の構築

ラット胚海馬ニューロンの懸濁液を取ります。

ニューロンを、微小電極アレイ(MEA)の接着因子でコーティングされた活性領域に移します。この活性領域はポリマー構造によって閉じ込められています。

MEAをインキュベートします。ニューロンはコーティングされたMEA活性領域に付着し、2Dニューロンネットワークを形成します。

さらに、ニューロンをマルチウェルプレート内のメンブレンインサート内の接着因子でコーティングされたガラスマイクロビーズ単層に移します。

ニューロンが接着因子でコーティングされたビーズに付着するようにインキュベートします。

接着ニューロンを持つマイクロビーズを、ニューロンネットワークを含む閉じ込められたMEA領域に移します。

マイクロビーズは自己組織化して六角形の構造を形成します。

MEA上でマイクロビーズの転写を数回繰り返し、自己組織化する層を構築し、パックされた3D構造を形成します。

MEA限定活性領域に培地を追加し、インキュベートします。

ニューロンは成長し、相互接続された3Dニューロンネットワークを形成します。

PDMS制約で定義されたMEAの活性領域に、2,000細胞/平方ミリメートルの密度で細胞をプレートして、2Dニューロンネットワークを作成します。次に、MEAデバイスを摂氏37度で5%加湿した二酸化炭素雰囲気のインキュベーターに入れます。

3D培養を構築するための準備ステップを完了するには、1マイクロリットルあたり600〜700細胞の細胞濃度で160マイクロリットルの懸濁液を、マルチウェルプレート内に配置されたマイクロビーズ単層の表面に分配します。次に、マルチウェルプレートを摂氏37度の5%加湿二酸化炭素雰囲気のインキュベーターに入れます。

プレーティングの6〜8時間後、マイクロビーズとニューロンを含む30〜40マイクロリットルの懸濁液をPDMS制約で区切られたMEAの領域に移します。各転写後、マイクロビーズが六角形のコンパクトな構造に自己組織化するまで約30分待ちます。すべての層が堆積し、自発的に組み立てられたら、PDMS制約で区切られた領域の上部に300マイクロリットルの培地を追加します。

MEAに結合した3D構造を、摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに48時間置きます。