ヒト多能性幹細胞を用いたアストロスフィアの生成と維持

まず、ECMでコーティングされたプレートと、Rhoキナーゼ阻害剤を含む増殖培地中のヒト多能性幹細胞のシードクラスターから始めます。

ECM は細胞付着を強化し、阻害剤は Rho-キナーゼをブロックし、アポトーシス細胞死を防ぎ、細胞の生存と増殖を促進します。

神経

分化培地を導入して、幹細胞を神経前駆細胞に分化させます。

剥離溶液で処理します。この溶液中の酵素はECMと細胞接触を分解し、細胞を放出します。

それらをRhoキナーゼ阻害剤を含むコーティングされていないフラスコに移します。

阻

害剤は、細胞の生存と三次元構造またはスフェロイドへの自発的な凝集を促進します。

スフェロイドに成長因子が豊富な神経分化培地を補充し、神経前駆細胞が星状細胞前駆細胞に分化し、天体球を形成できるようにします。

定期的に、天体圏をより小さなクラスターに解離させるための分離溶液を追加します。これにより、栄養素がスフェロイドの内部細胞に到達し、その生存率を維持することができます。

前駆細胞がアストロサイトに成熟するために、アストロスフェアを新鮮な培地に維持します。

まず

、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を含む2ミリリットルのhPS細胞培地にhPS細胞のクラスターをECMでコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに播種します。幹細胞が約50%コンフルエントになるまで幹細胞を維持します。次に、培地をSP-431542とDMH1を含む神経培地に変更して、神経誘導を促進します。

細胞が約95%コンフルエントになったら、各ウェルを1〜6で新しいECMコーティングウェルに分割します。14日目に、細胞を剥離溶液で解離し、各ウェルの内容物をY-27632を含む培地を含むコーティングされていないT-25フラスコに移して、凝集体の形成を促進します。

自発的に形成された3D凝集体にアストロサイトの前駆細胞とアストロサイトを生成するには、EGFとFGF2を含む神経培地に切り替え、4〜6か月でアストロサイトの同一性が確認されるまで3〜4日ごとに給餌します。

デフォルトでは、このプロトコルは背側皮質星状細胞を生成します。ただし、アストロサイトのサブタイプは、必要に応じてパターニングモルフォゲンを追加することによって局所的に指定できます。

週に一度、暗い中心が現れたら、遠心分離によって球体を収集し、H-astro凝集体を剥離溶液で穏やかに解離させます。非CNS細胞および非神経細胞の継代を避けるために、自発的に付着しない球

のみを再プレートします。