JoVE 実験百科事典
Neuroscience
0 回視聴 • 3:09 分 • July 8th, 2025
マウス胚性幹細胞懸濁液を取ります。
遠心分離し、上清を除去し、細胞を神経分化培地に再懸
濁します。懸濁液の液滴を培養プレートの蓋の内側に置きます。
液滴の乾燥を防ぐために、底板に緩衝液を追加します。底板に蓋を置き、吊り下げ滴培養を形成し、インキュベートします。
重力により、細胞はクラスター化され、胚様体またはEBと呼ばれる3次元凝集体を形成します。
液滴を分化培地を含むプレートに入れ、EBの増殖のために攪拌下でインキュベートします。
遠心分離して培地を取り除きます。レチノイン酸を添加した分化培地にEBを再懸濁し、培養プレートに移し、インキュベートします。
レチノイン酸が細胞に入り、転写複合体の形成を引き起こします。この複合体は遺伝子発現を誘導し、神経前駆細胞への分化を引き起こします。
差別化されたEBは、下流のアプリケーションに対応しています。
まず、ハンギングドロップセル培養をセットアップします。10センチメートルの細胞培養プレートの場合、分化培地20マイクロリットルあたり500細胞に濃度を調整します。50個の20マイクロリットルの液滴に十分な細胞懸濁液を調製します。マイクロピペットまたはリピーターピペットを使用して、20マイクロリットルの細胞懸濁液の液滴を組織培養プレートの蓋に置き、液滴が融合しないように近づきすぎないようにします。
プレートに5〜10ミリリットルのPBSを入れ、慎重に蓋をプレートに戻します。摂氏37度のインキュベーターで培養物をインキュベートします。2日後、蓋から液滴を集め、10ミリリットルの分化培地で満たされた10センチメートルの細胞培養懸濁プレートに入れます。次に、インキュベーター内で低速に設定されたオービタルシェーカーにプレートを置きます。さらに2日後、細胞を200倍gで3分間遠心分離し、上清を除去します。
胚様体の神経前駆細胞への分化を誘導するには、細胞を5マイクロモルレチノイン酸を含む分化培地に再懸濁します。プレートを2日間インキュベートします。次に、プレートを傾けてピペットで取り出すことで、培地の少なくとも半分を新鮮な培地に交換します。