高密度ニューロンフィーダー層を用いた超低密度ニューロン培養物の作製

まず

、2つのマルチウェルプレートから始めます:1つはポリマーでコーティングされたエッチングされた底部を持ち、もう1つはポリマーでコーティングされたカバーガラスを備えています。

胚性ニューロンの高密度懸濁液を、底がエッチングされたプレートに播種します。ウェルを含むカバーガラスに超低密度ニューロン懸濁液を追加します。

ニューロンがポリマーに付着できるようにインキュベートします。

カバーガラスを取り外し、高密度ニューロン培養の上に置き、ニューロンが向かい合うようにします。

隆起した構造を持つエッチングされた表面は、密度の異なるニューロンを分離するマイクロスペースを作成します。

高密度培養物はフィーダー層として機能し、神経成長因子を分泌します。

拡

散空間が限られているため、成長因子はニューロンの周囲に蓄積し、ニューロンの成長とニューロン突起の発達

を促進します。

非神経細胞の増殖を選択的に阻害するシトシンアラビノシドを含む神経基底培地を導入します。

ニューロン培養を維持するために、新鮮な神経基底培地を定期的に補充します。

この手順では、高密度ニューロン用の底をエッチングした24ウェルプレートを培養フードに入れます。300マイクロリットルの前処理培地を真空で除去します。次に、0.6ミリリットルの高密度細胞懸濁液を1ミリリットルあたり250,000ニューロンにプレートします。

カバーガラス付きの他の224ウェルプレートを培養フードに入れます。カバーガラスに1ミリリットルあたり10,000ニューロンで0.6ミリリットルの低密度細胞懸濁液をプレーティングする前に、真空で300マイクロリットルの前処理培地を除去します。その後、24ウェルプレートのすべてをインキュベーターに戻し、2時間インキュベートします。その後、ニューロンが付着した低密度カバーガラスを高密度培養物に裏返し、ニューロンが向かい合っていることを確認します。続いて、共培養した2つのプレートをインキュベーターに戻します。

DIV 5で300マイクロリットルの新鮮な飼料培地を加えて、共培養物に供給します。この最初の給餌に続いて、シトシンアラビノシドを含まない300マイクロリットルの新鮮な給餌培地を毎週各ウェルに加えます。培養物を1か月以上保持する場合は、1か月の時点を超えて、毎週培地の半分を新鮮な飼料培地と交換します。