ブタの脳からの毛細血管の浄化

ブタの脳を取ります。

髄膜細胞の汚染を防ぐために、脳を覆う保護膜である髄膜を取り除きます。

毛細血管が豊富な領域である灰白質をこすり落とし、培地を含む培養皿に組織を収集します。

灰白質を針なしで注射器に通し、組織を断片化します。

断片をホモジナイザーに移し、均質化して組織をさらに崩壊させ、脳毛細血管を放出します。

ホモジネートを特定の孔径のフィルターに通して毛細血管を保持し、他の脳細胞が通過できるようにします。

酵素とDNaseを含む溶液にフィルターを入れます。

酵素は接着細胞を剥離し、DNase は汚染された DNA を分解し、純粋な毛細血管の単離を促進します。

フィルターから毛細管を洗います。

血清タンパク質を含む培地を加えて酵素を不活性化します。

毛細血管をチューブに移し、遠心分離し、上清を除去します。さらなる分析のために、純粋な毛細血管を新鮮な培地に再懸濁します。

この手順を開始するには、脳を滅菌フローベンチに入れ、氷の上に置いたビーカーで1リットルのPBSで優しく洗浄します。次に、先端の細い鉗子を使用して各脳から髄膜を慎重に取り除きます。メスを使用して、脳から灰白質を一度に1つずつこすり落とし、分離された物質を氷上に置いた20ミリリットルのDMEM / F12を含むペトリ皿に移します。

最初の断片化のために、針なしで灰白質材料を50ミリリットルの注射器に通します。すべての脳に対してこの手順を繰り返し、収集した灰白質物質をプールします。DMEM/F12培地で単離された灰白質材料をハンドヘルド組織ホモジナイザーのグラインダーチューブに移します。緩い乳棒で上下に8回ストロークし、続いてタイトな乳棒で上下に8ストロークして材料を均質化します。

次に、フィルターホルダーと140ミクロンのフィルターメッシュを備えた500ミリリットルの青いキャップボトルを使用してホモジネートをろ過することにより、毛細血管を分離します。フィルターを含むキャピラリーを消化液と一緒にペトリ皿に入れます。その後、ペトリ皿を摂氏37度でオービタルシェーカーで180RPMで1時間インキュベートするか、10分ごとに穏やかにかき混ぜます。

1時間後、ペトリ皿からの懸濁液でフィルターから毛細管を洗い流します。次に、3つの皿からの懸濁液を2つの50ミリリットルチューブに分割し、各50ミリリットルチューブに10ミリリットルのDMEM / F12を加えて消化を停止します。

細胞懸濁液を250倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、各ペレットを10ミリリットルのDMEM / F12に再懸濁します。次に、さらに20ミリリットルのDMEM / F12を各チューブに加えます。