内皮細胞との共培養中のアジドシュガーによる神経細胞表面マーカーの標識

まず、

マウス脳内皮細胞懸濁液をトランスウェルプレートの透過性膜インサートに追加します。

底に成長培地をよく加え、インキュベートします。

培地中の成長因子と栄養素は、細胞が単層として成長するのを助けます。

培地を底のウェルとインサートから取り除きます。

インサートの内面と外面を洗浄して、破片を取り除きます。

インサートに接着培地を加え、インサートを初代皮質神経幹細胞および前駆細胞(NSPC)を含むマトリックスコーティングウェルに移し、インキュベートします。

非天然のシアル酸前駆体類似体であるアジド糖を内皮細胞とNSPCの両方に添加し、インキュベートします。

内皮細胞から分泌されるサイトカインとケモカインは、NSPCの大きなシート状クローンへの成長を促進します。

アジド糖は、NSPC細胞表面のシアログリカン構造に組み込まれ、糖タンパク質を標識します。これにより、拡張されたNSPC上の細胞表面タンパク質の同定が可能になります。

内皮細胞を調製するには、0.10センチメートルのシャーレからBEND3細胞ペレットを90ミリリットルのBEND3細胞培地と90%コンフルエンスで再懸濁します。1ミリリットルの細胞懸濁液を1つの透過性サポートインサートに加えます。マトリックスの下部チャンバーにウェルあたりさらに2ミリリットルのBEND3培地を追加します。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で1日培養し続けます。

インサート内の細胞をプレーティングした1日後、最初に下部チャンバーから、次にインサートから培地を穏やかに吸引します。インサートの表面を予熱したDMEMで3回洗浄します。インサートの外面を予熱したDMEMですすいで洗浄します。次に、1 ミリリットルの予熱した AM を 1 つのインサートに加えます。インサートを初代皮質細胞を含むウェルに移します。共培養物を摂氏37度で5%二酸化炭素とともに12時間インキュベートします。

Ac₄ManNAzをDMSOに溶解して、200ミリモルのストック濃度を達成します。インキュベーターから神経内皮共培養プレートを取り出します。1マイクロリットルのAc₄ManNAzストックを各ボトムチャンバーに加え、インサートごとに0.5マイクロリットルを共培養に加えます。細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で5日間培養します。細胞が培養されている間に、インサートあたり100マイクロリットルのRMと、下部チャンバーあたり200マイクロリットルのRMを加えて、内皮細胞と神経細胞に1日おきに再供給します。