機械的均質化によるマウス脳からの複数細胞タイプの単離

まず

、ティッシュグラインダーのコンポーネントを氷の上に置きます。この装置には、乳鉢と直径の異なる2つの乳棒が含まれています。

冷やした塩緩衝液を乳鉢に注ぎ、マウスの脳組織を加えます。

緩衝液は浸透圧バランスを維持し、細胞の構造と機能を維持します。

組織

を機械的に細かくせん断する小径の乳棒を使用して、複数の穏やかなストロークで組織を粉砕します。

次に、より大きな直径の乳棒でストロークし、組織の構成細胞へのさらなる分解を促進します。

混合物をチューブに移し、遠心分離します。

上清を取り除きます。

冷やした塩緩衝液を加え、ボルテックスして細胞の塊とミエリンを破壊します。

次に、密度勾配媒体と遠心分離機を追加します。

形状と質量の違いにより、細胞は下層に沈殿し、破片とミエリンは最上層に蓄積します。

上清を捨てます。

適切な溶液を加えて、さらに使用するための多細胞懸濁液を得る。

組織の均質化のために、Dounceティッシュグラインダーの予冷ガラスモルタルに3ミリリットルの予冷したHBSSを加え、採取した脳の1つの半分をモルタルに移します。乳棒Aを10ストロークし、続いて乳棒Bを10ストロークで組織を穏やかに浸軟させ、均質化された混合物を新しい15ミリリットルの円錐形チューブに移します。

チューブを最終容量10ミリリットルまで、遠心分離のために予冷したHBSSを充填し、サンプルを氷上に保持する前に、ボルテックスでペレットを7ミリリットルの新鮮なHBSSに再懸濁します。破片を除去するには、消化または均質化された各サンプルに3ミリリットルの予冷等張溶液を加え、サンプルを穏やかにボルテックスして均一に混合されていることを確認します。

次に、サンプルを遠心分離し、溶液の表面に浮遊する破片とミエリンの白っぽい円盤を慎重に取り除きます。破片が廃棄されたら、ペレットを乱すことなく、各チューブから最後の100マイクロリットルの上清を除くすべてを収集します。各ペレットを1ミリリットルのFACS/BL溶液に再懸濁し、個々の1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。

粒子溶液で遠心分離した後、サンプルの損失を避けるために、細胞ペレットを外さずに、破片ディスクと上清を非常に慎重に除去することが重要です。

遠心分離後、各チューブから上清を慎重に吸引し、チューブあたり350マイクロリットルの新鮮なFACS/BLにペレットを再懸濁します。