ショウジョウバエ幼虫神経細胞における微小電極媒介FM色素のローディングとアンローディング

ショ

ウジョウバエの幼虫から始めて、露出した筋肉と神経線維を蛍光膜色素またはFM色素の小胞を含む溶液に浸します。

FM色素は細胞膜の脂質に結合し、その上に蛍光コーティングを形成します。

マイクロマニピュレーターユニットを使用して、吸引微小電極の先端を顕微鏡下に配置します。

神経線維と微小電極に焦点を当てます。

負圧を使用して、神経線維のループを微小電極に吸い込みます。

電流パルスを印加して神経線維を刺激します。

これにより、運動ニューロンが筋線維に接続する神経筋接合部が引き起こされ、シナプス小胞エンドサイトーシスが開始されます。

このプロセス中に、細胞はFM色素でコーティングされた膜を飲み込んで染色されたエンドサイトーシス小胞を形成し、神経伝達のシナプス前段階を視覚化するのに理想的です。

FM染料を洗い流し、外用溶液を交換します。

電流パルスを印加して、FM色素で染色された小胞をセルから降ろします。

電気刺激の場合は、微小電極プーラーを使用して吸引ピペットを準備し、必要なテーパーとチップサイズを取得します。その後、マイクロフォージで微小電極の先端を火磨きし、単一の運動神経を吸い上げるときにぴったりとフィットします。

吸引ピペットを、長くて柔軟なプラスチックチューブとシリンジに取り付けられたマイクロマニピュレーターの電極ホルダーにスライドさせます。次に、FM色素で製剤を顕微鏡ステージに置き、幼虫と吸引ピペットに焦点が合うまでステージを上げます。

次に、切断された運動神経のループを吸い上げ、注射器によって生成された負の空気圧で選択した半セグメントを吸引電極に神経支配します。続いて、選択したパラメーターを使用して運動神経を刺激し、SVエンドサイトーシスとFM1-43色素の取り込みを促進します。

手順のこの時点で最も重要なステップは、単一のモーター軸索をしっかりと吸引電極に吸い込むことです。これには試行錯誤が必要になる場合があります。適切な吸引電極が見つかったら、一貫した刺激強度を確保するために、比較するすべての条件で同じ電極を使用します。

FM色素のアンロードでは、同じ運動神経を同じ電極に吸引し、運動神経を刺激してSVエキソサイトーシスとFM1-43色素の放出を活性化します。