JoVE 実験百科事典
Neuroscience
0 回視聴 • 3:47 分 • July 8th, 2025
脳細胞と浸潤免疫細胞を含む灌流虚血性マウス脳組織を取ります。
ストレーナーで組織をみじん切りにし、バッファーですすいでください。
濾液を遠心分離し、上清を廃棄します。
ペレットを消化酵素溶液に再懸濁し、微量遠心チューブに移します。
消化酵素が細胞外マトリックスを分解し、細胞を緩めるためにインキュベートします。
懸濁液をろ過し、DNaseを含むバッファーですすぎ、汚染DNAを除去します。
次に、DNaseフリーバッファーで洗浄します。
濾液を遠心分離し、上清を廃棄します。
細胞を密度勾配培地に再懸濁します。次に、内容物を新しいチューブに移して混合します。遠心分離機で成分を密度で分離します。
ミエリンと破片を含む上清を取り除きます。
ペレットをDNaseフリーバッファーに再懸濁します。新しいチューブに移し、再度遠心分離します。
上清を廃棄して、密度勾配媒体を十分に除去します。
最後に、さらなる分析のために細胞をバッファーに再懸濁します。
5ミリリットルのシリンジのプランジャー端を使用して、脳組織の断片を100ミクロンの細胞ストレーナーに通し、カルシウムとマグネシウムを含む氷冷HBSSでストレーナーを継続的にすすぎます。次に、均質化された組織を氷の上に置きます。
すべてのサンプルが処理されたら、細胞懸濁液をスピンダウンします。そして、上清を慎重に捨てます。ペレットを1ミリリットルの消化バッファーに再懸濁します。次に、細胞懸濁液を2ミリリットルのチューブに移します。
そして、摂氏37度でゆっくりと連続回転して細胞をインキュベートします。1時間後、細胞懸濁液を70ミクロンの細胞ストレーナーでふるいにかけます。そして、DNaseを含む3ミリリットルの洗浄バッファーでフィルターを完全にすすいでください。次に、15ミリリットルのDNaseフリー洗浄バッファーでストレーナーを洗浄します。セルをスピンダウンし、上清を捨てます。
細胞破片とミエリンを除去するには、細胞を5ミリリットルの室温25%密度勾配培地に再懸濁し、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。細胞とグラジエントを十分に混合し、穏やかなピペッティングを繰り返します。次に、細胞溶液をスピンダウンします。
分離の最後に、ペレットを乱さずにミエリンコートと上清を注意深く吸引します。そして、細胞を10ミリリットルのDNaseフリー洗浄バッファーに再懸濁します。細胞を15ミリリットルのチューブに移し、再び回転させ、ペレットを100マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーに再懸濁します。