Name: 栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶマウス胚性線維芽細胞を栄養膜幹細胞へ直接変換する方法。一過性の転写因子発現により安定したiTSCを選択し、胚盤胞と胚外系譜の分化メカニズムを解明する。幹細胞生物学と胎盤発生研究に応用可能。

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すべてのマウス実験は動物保護のドイツの法律に基づいて行われ、地元の機関動物ケア委員会（Landesamt fuerナチュール、UMWELTウントVerbraucherschutz、ノルトラインヴェストファーレン州[承認ID番号の承認と一致した：AZ 84-02.04.2013 .A428]）。 1.メディアの準備<ol><li>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）：293T媒体を準備します。 </li><li> MEF培地を調製する：DMEM、10％（v / v）のFBS、L-グルタミン（2mM）、​​1×非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。 </li><li> TS媒体を作製（W / FGF4 /ヘパリンO）：ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）1640を20％（v / v）のFBS（幹細胞培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2 mMの）、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、2-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）。 </li><li>幹細胞（RPMI 1640、20％（v / v）のFBS：FGF4 /ヘパリン（TS + F4H）とTSの培地を調製培養グレード）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）、L-グルタミン（2mM）、​​ピルビン酸ナトリウム（1 mM）の、2-メルカプトエタノール（0.1ミリモル）、25 ngの/ mlのFGF4、を1μg/ mlのヘパリン。 注：FGF4およびヘパリンを直接使用直前に培地に添加されます。 </li><li> FGF4 /ヘパリン（TS-CM + F4H）とTS-CMを準備：70％MEF馴化TS培地+ 30％新たに調製したTS培地+ 25 ngの/ mlのFGF4、を1μg/ mlのヘパリンを。 注：FGF4およびヘパリンを直接使用直前に培地に添加されます。 </li><li>トランスフェクション培地を調製する：アドバンストDMEM、2％（v / v）のFBS（細胞培養グレード幹）、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。 </li><li>ウイルス生産培地を調製：アドバンストDMEM、5％（v / v）のFBS（細胞培養グレード幹）、L-グルタミン（2mM）、​​ペニシリン/ストレプトマイシン（1X）。 </li></ol> 2.マウス胚性線維芽細胞の導出<ol><li> B6.Cg-GT（ROSA）26Sor TM1（のrtTA;（株名を重量129S2SV。女性とホモ接合男性R26 :: rtTAのマウスを使用して設定時限交配* M2）ジェジュン/ J 7）。頸椎脱臼によりE13.5の犠牲マウス上の標準的なプロトコル8に従って初代マウス胚性線維芽細胞（MEFの）を単離。その後、MEF培地で150ミリメートル皿上の1つの胚からのプレートの細胞。 </li><li>一次MEFの文化が150 mmディッシュにコンフルエントに達すると、10mlのPBSで細胞を2回洗浄し、4ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTA溶液を追加します。 37℃のインキュベーターで4分 - 3用の皿をインキュベートします。 </li><li>インキュベーションチェックした後、倒立顕微鏡（10倍レンズを使用して）を使用してディッシュから剥離した細胞の場合。トリプシン処理を停止し、50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を収集するためにMEF培地を5ml加えます。 </li><li>いくつかの料理からプールの細胞懸濁液を、50mlのコニカルチューブに集めます。 200×gで、10℃で3分間遠心操作し細胞懸濁液。 </li><li>上清を捨て、10％を含むFBS中（v / v）のジメチルスルホキシドを細胞ペレットを再懸濁します。さらに使用するためにアリコートでのMEFをフリーズします。 注：または、野生の標準を使用します電子プライマリのMEF。ただし、のrtTAを発現する追加のレンチウイルスベクターは、他のレンチウイルスベクターと一緒に形質導入する必要がある（Maherali ら FUdeltaGW-rtTAのプラスミドを用いて、例えば、 図9）。 </li><li> MEF馴化TS培地の調製 注：変換前の実験に、MEF馴化（CM）TSメディアは（セクション6で説明）、個々のITSC株の継代培養のために必要とされる、準備しなければなりません。 <ol><li>プレート皿の所望の数にMEF培地中の150ミリメートル皿当たり1×10 7有糸分裂不活性化したMEF。 9グレイの線量でγ線照射によってのMEFを不活性化します。 注：150 mmディッシュあたりの収量は約60ミリリットルのCMです。 </li><li>メッキ、吸引後の日とは、MEF培地を廃棄し、戻って37℃のインキュベーターにしたMEFと場所料理、有糸分裂不活性化の各皿の上にたて（FGF4 /ヘパリンなし）TS培地を用意し20ミリリットルを追加します。 </li><li>インキュベートした後有糸分裂が不活性化されたMEF上で3日間のTS培地は、50ミリリットルコニカルチューブ中の培地を収集します。 0.2μmのフィルターを通して媒体を濾過し、2.6.4に進みます。 CMのさらなるバッチの製造のための新たなTS培地20mlでCMを交換してください。 注：有糸分裂不活性化MEFの3回までのCMの調製のために使用することができます。 </li><li>小分けし、-20℃で50ミリリットルコニカルチューブとストアにフィルタリングCMの35ミリリットル必要になるまで。解凍後、1ヶ月まで4℃で70％TS-CMを得るために、店舗に新たに調製したTS培地の15ミリリットルを追加します。 </li></ol></li></ol> 293T細胞における3.レンチウイルスベクターの作製注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2にライセンス実験室のスペースで行われます。 <ol><li>変換実験に先立って、過剰発現TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2とmCherryをの依存ドキシサイクリン（DOX）のためのレンチウイルスベクターを準備します。各レンチウイルスについては、同時トランスフェクト293T細胞を使用してパッケージングプラスミドおよびVSV-Gを発現するエンベローププラスミドと一緒にそれぞれのレンチウイルス導入ベクター（プラスミドについては、材料表を参照してください）​​。 注：ウイルス生産に関する役立つ情報についてGavrilescu ら 10を参照してください。それはレトロウイルスの生産を説明していますが、293T細胞とプラスミドDNAの品質に関する一般的なコメントは、同様に、レンチウイルス生産のための真です。 注意：適切な安全対策は、レンチウイルスベクターと仕事での作業はバイオセーフティレベル2の施設で行わなければならないとき、取られる必要があります。 </li><li>コー​​トポリ-L-リジン（100μg/ mlの）溶液5mlで皿を覆い、静かに均一に塗布液を分配するように揺動することにより溶液で5 100 mmディッシュ。 37℃で30分間バックインキュベーターに皿を置きます。 30分吸引塗布液の後、PBSで一度皿をすすぎます。 </li><li>プレート7×10 10ミリリットル293T-細胞培地、s内の皿当たり6 293T細胞Wirlの料理は細胞を均一に分散し、戻って37℃のインキュベーターに皿を配置します。 </li><li>翌朝は、トランスフェクション培地5mlで成長培地を交換してください。クロロキン液の1,000倍ストック（25mMの）の6μlを添加して、戻って37℃のインキュベーターに皿を置きます。 </li><li> 一方、トランスフェクション混合物を準備します。 <ol><li>各レンチウイルスベクターの場合、AとBというラベルの付いた2つの5ミリリットルの反応管を、準備</li><li> 2×HEPES600μlのは、チューブAに生理食塩水（HBS）をバッファリング追加</li><li> 18.5μgのレンチベクターDNAと9.25μgのpsPAX2とpMD2.G.の9.25μgの持つ管Bミックスで61.5μlの塩化カルシウム溶液（2 M）、無菌培養グレードのH 2 Oで600μlに音量を調節します</li><li>ボルテックスしながら管Bの滴下からチューブAにソリューションを追加します。 RTで15分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。 </li></ol></li><li> 100ミリメートル皿に準備された293T細胞に滴下し、非常に慎重にトランスフェクション混合物を追加します。 AFTER 5〜6時間培地除去およびウイルス生産培地10mlで交換してください。バック37℃のインキュベーターに皿を置きます。 注：培地を除去し、交換時に293T細胞を容易に皿から切り離すので、ご注意ください。クロロキンへの長期曝露が細胞に毒性であるため、トランスフェクション後の培地交換5-6時間は、非常に重要です。 </li><li>翌朝は、慎重に取り外し、メディア破棄し、ウイルス生産培地の7ミリリットルと交換してください。 </li><li>翌朝は、ウイルス含有培地の最初のバッチを収穫します。培地を吸引し、15ミリリットルコニカルチューブに集めます。ここでも、細胞上にウイルス産生培地の7ミリリットルを追加します。冷蔵庫に保管してウイルス含有培地第二のバッチは、次の日に収穫されるまで。 </li><li>翌朝は、最初のバッチを含む15ミリリットルコニカルチューブに追加するウイルス含有培地の第二のバッチを吸引します。 293T細胞は現在、廃棄することができます。 0.45μmのシュールを通じてウイルス含有培地をフィルタリングfactantフリー酢酸セルロース-membraneフィルタ。アリコートは、さらなる使用のために-80℃で、ウイルス含有培地とストアを濾過しました。 注：ウイルス産生はまた、6ウェル皿中で行うことができます。それに応じてボリュームと細胞数を縮小。 </li></ol> 4. 4要因と線維芽細胞の形質導入およびmCherryをコントロールベクター注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2の施設で行われています。 <ol><li>実験概要の概略について図1を参照してください。プライマリのrtTA-のMEFの1つのアリコートを解凍し、MEFメディアの2ミリリットルの全容量で6ウェル皿のウェルあたり3.33×10 5細胞をプレー。少なくとも3ウェルを準備し、4因子（4F）、mCherryをとコントロールでそれらにラベルを付けます。 注：のrtTA発現するレンチウイルスベクターは、ステップ4.2の間にレンチベクターのカクテルに追加されたときあるいは、野生型MEFを、使用することができます。 </li><li>完全にcryopreから回収した細胞の後、次の日servationは、それぞれ、伝達メディアの0.6ミリリットル（4F）、0.9ミリリットル（mCherryを）と1ミリリットル（コントロール）との3 6ウェルにMEFメディアを交換します。 RTでPLV-のtetO-TFAP2C、-Gata3、-Eomes、-etsと-mCherryウイルスの1つのアリコートを解凍し、よく4Fにそれぞれのウイルス含有上清100μl（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）を追加します。 注：野生型のMEFの場合は、100μlのことでpreplatedメディアの容量を削減し、さらに4Fミックスに上清を含むFUdeltaGW-のrtTAウイルスの100μlを添加します。 </li><li>よくmCherryをで標識にmCherryをウイルス含有培地100μlのを追加します。各ウェル中の8μg/ mlの最終濃度にポリブレンを加えます。 37℃でバックインキュベーターに皿を置き、ウイルス含有上清としたMEF O / Nインキュベートします。 注：野生型のMEFの場合は、100μlのことでpreplatedメディアの容量を削減し、さらにFUdeltaGW-のrtTAウイルス含有上清100μlを追加します。 </li><li>翌朝、慎重に取り外しウイルス含有培地及び2mlのPBSで三回洗浄します。最後に、（FGF4 /ヘパリンなし）TSメディアの2ミリリットルを追加します。 注：形質導入したMEFを直接ITSC誘導実験のために使用されるか、またはさらなる使用のために凍結することができます。 </li></ol> 5.線維芽細胞ITSCへの変換注：すべてのステップはバイオセーフティレベル2にライセンス実験室のスペースで行われます。 <ol><li> 4分 - 2ミリリットルのPBSで3インキュベーターでそれらをインキュベート0.5ミリリットルのトリプシン/ EDTA溶液を添加した後、二回形質導入したMEFを洗ってください。細胞の適切な剥離用倒立顕微鏡下で確認してください。 <ol><li> 1mLのTS培地を添加することによってトリプシンを不活性化します。 200×gで3分間、15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。上清を捨て、2ミリリットルのTS培地で細胞を再懸濁します。細胞をカウントするために形質導入​​されていない対照試料を使用してください。 </li><li> 2×10 5の密度でプレート4F-MEFを、mCherryを-のMEFおよび非形質導入コントロールのMEF各培地を2μg/ mlのdox（TS培地+ FGF4 /ヘパリン+ DOX）を含む10ミリリットルのTSさ100mmの細胞培養皿当たりの細胞。 </li><li>また、小さい皿に分化転換を行います。それに応じて希望の皿の大きさ、スケールのボリューム上の1cm 2あたり3.6×10 3細胞をプレー。 </li></ol></li><li>翌日、形質導入効率を推定するためにmCherryをタンパク質の発現をモニター（10×レンズと赤色蛍光励起のために適切なフィルタを使用して）落射蛍光顕微鏡を使用して。 注：形質導入効率は100％に近くなければなりません。増加した細胞死は、導入遺伝子誘導後に明らかである場合、これは、ウイルス力価が高すぎたことを意味します。形質導入は、ウイルス含有培地の量が減少して繰り返されるべきです。 </li><li>今から全ての料理に変化媒体一日おきにプレーティングの翌日10時まで。その後、DOX（TS培地+ FGF4 /ヘパリン）することなく、TS培地で細胞を養います。 </li><li>倒立顕微鏡モニター用を使用して、最大3週間4F皿上の「分化転換領域」の外観（ 図2BおよびCを参照してください）。このようなコロニーは、2つの制御ディッシュ（mCherryを-のMEFおよび非形質導入したMEF）上には表示されません。 </li></ol>個人ITSC行の6の単離注：ステップ6.3のために組織培養フードは必要ありません。細菌汚染の可能性を最小限にするために70％エタノールで倒立顕微鏡を拭くことをお勧めします。個々ITSCコロニーを日21および分化転換の28日の間に単離することができます。 <ol><li> 96 U底ウェルディッシュの12ウェルに0.05％トリプシン/ EDTA溶液40μlを加え、氷上で皿を置きます。 </li><li>コロニー分離、4F-MEF分化転換皿上の培地を吸引する前に。 10mlのPBSで細胞を1回洗浄します。ここでも、倒立顕微鏡下で10mlのPBSと場所皿を追加します。 </li><li> 40μlに設定し、100μlのピペットを使用してcで、個々のコロニーを持ち上げますピペットチップでそれらをirclingと浮遊コロニーを吸引します。調製された96ウェルディッシュの1ウェルに1つのコロニーそれぞれの転送細胞。 12個のコロニーをピッキングした後5分間37℃のインキュベーター中で96ウェル皿を置きます。 </li><li> TS-CM培地（30％新鮮なTS培地+ 70％のCM + FGF4 /ヘパリン）の準備を500μlで24ウェルディッシュの1ウェルに数回、転送細胞懸濁液のために上下にピペッティングにより細胞を解離します。 </li><li>次の日は死んだ細胞を除去し、新鮮なTS-CM培地で培地を交換してください。一日おきに培地交換。 </li><li>明るい境界線（ 図2参照）との上皮コロニーの出現を監視します。コロニーが表示されたら、文化70％コンフルエントになるまで、または最長1週間、徐々に、より大きな皿を上に展開します。今から、正真正銘のTSCなどの培養細胞、血清含有培地中または無血清、定義されたメディア3,5,11における標準プロトコルに従って。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで紹介する4因子（TFAP2C、GATA3、Eomes、ETS2）ベースの分化転換プロトコルは、マウス胚性線維芽細胞から忠実に変換iTSCsを生成するために、信頼性の高い方法を提供しています。さらに、この方法はあるが、胚性線維芽細胞3に比べて効率の低下で、また出生後の尾の線維芽細胞に適用可能です。一般的に、初代線維芽細胞の品質は、分化転換の結果とケアの重要な要因は、初期継代細胞（継代2〜3）を使用するように注意しなければならないです。 このプロトコルの強さは、導入遺伝子発現の時間的制御を可能にドキシサイクリン誘導性ベクターの使用です。これは、導入遺伝子発現のTSC運命の独立を維持し、内因性の転写因子ネットワークを活性化し、安定ITSC株の生成を可能にします。これは、胚性幹細胞からのTSCの運命の誘導を説明する、以前に公開されたプロトコルとは対照的である、方法THAこれまでのtは不完全にしか再プログラミングされた栄養膜幹細胞様細胞1が得られます。 しかしながら、ここで説明されたプロ...

最近、トロホブラスト幹細胞の変換にマウス胚性幹細胞のいくつかのアプローチを比較した研究では、全ての分析システムにおいて、系統変換が不完全のままであることを明らかにしました。代わりに誘導された栄養膜幹細胞（iTSCs）のいわゆる栄養膜幹細胞様細胞は、起源1の細胞運命のメモリを保持生成されています。ここでは、ITSC世代の異なるアプローチを行いました。マウス胚性線維芽細胞（MEF）2からの多能性幹細胞の直接誘導と同様に、iTSCsは直接分化した体組織から変換されています。まず、MEFにおける過剰発現された場合、TSCの運命を誘導する12候補因子を同定しました。その後、要因TFAP2C、GATA3、EomesとETS2はITSC誘導3のために必要かつ十分であることが確認されています。同時に、別のグループは、独立して、TFAP2C、GATA3及びEomesがiTSCs中のMEFに変換するのに十分であることがわかりました。しかし、その中で研究は、導入遺伝子発現のために必要な時間がかなり長いETS2に転換カクテル4に存在しない場合、別の変換速度を示し、我々の研究と比較されます。 誘導し、胚盤胞由来トロホブラスト幹細胞の培養物を含有する従来のウシ胎児血清（FBS）は、成長不活性化MEFの5,6によって分泌される因子の存在に依存しています。 ITSC​​誘導時には、これらの要因は、導入遺伝子の完全な組み合わせを欠いており、分化転換を受けていないのMEF、によって提供されています。しかし、一度個々のITSCコロニーは彼らが成長不活化したMEFによってあらかじめ調整されたメディアを、必要とする、サブ培養されます。そこから先、iTSCsを培養し、標準的なプロトコルに従って胚盤胞派生のTSCのように処理することができます。注目すべきは、細胞培養皿をゲル化することなく、田中ら 5、私たちが日常的に文化のTSCとiTSCsとは対照的です。

<table><tbody><tr><td>ドキシサイクリンヒクレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-10G</td><td>滅菌PBSに溶解し、2mg / mlのストック溶液を調製します。アリコートを-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>クロロキン二リン酸塩&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628-25G</td><td>滅菌細胞培養グレードの水で25 mMのストック溶液を調製します。アリコートを-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>滅菌細胞培養グレードの水で8 mg / mlのストック溶液を調製します。アリコートを-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>の人間の組換えの線維芽細胞の成長因子4</td><td>ReliaTech</td><td>300-131L</td><td>はPBSの無菌0.1%BSAで分解し、25を調製し、micro;g / mlストックソリューション。アリコートを-80°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td>無菌PBSに溶解して1 mg/mlの原液を調製します。アリコートを-80°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>ProFection 哺乳類トランスフェクションシステム</td><td>Promega</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>PBS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1419-094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640、グルタミンなし</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03IR</td><td></td></tr><tr><td>界面活性剤フリーの酢酸セルロースメンブレンフィルター</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25030-24</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)、細胞培養グレード</td><td>Panreac AppliChem GmbH</td><td>A3672,0100</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Tfap2c</td><td>Addgene</td><td>70269</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Gata3</td><td>Addgene</td><td>70270</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Eomes</td><td>Addgene</td><td>70271</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-Ets2</td><td>Addgene</td><td>70272</td><td></td></tr><tr><td>pLV-tetO-mCherry</td><td>Addgene</td><td>70273</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19780</td><td></td></tr><tr><td>マウスB6。CG-GT(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7</td><td>JAX マウス</td><td>6965</td><td></td></tr><tr><td>129S2SV</td><td>Charles River</td><td>129</td><td></td></tr></tbody></table>

栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

Protocol for the Direct Conversion of Murine Embryonic Fibroblasts into Trophoblast Stem Cells

トロホブラスト幹細胞（のTSC）哺乳類の発生における最初の細胞の運命決定の結果として生じます。彼らは、自己再生および栄養膜系譜のすべてのサブタイプに分化する、胎盤の胎児部分を生じさせる細胞集団を幹の生体内と同等の能力を保持し、in vitroで培養することができます。したがって、のTSCは、in vitroで胚体外細胞運命の決定に対する胎盤の開発および胚を研究するためのユニークなモデルを提供しています。以降、胚盤胞段階から、DNAメチル化とヒストン修飾からなる別個のエピジェネティックな障壁がしっかりと両方の系統を分離します。ここで、我々は完全に過剰発現マウス胚性線維芽細胞における栄養膜重要な調節因子TFAP2C、GATA3、EomesとETS2の一過性のことで、この系統の障壁を克服するためのプロトコルについて説明します。誘導された栄養膜幹細胞は自己再生が可能で、派生トロホブラスト幹細胞を胚盤胞とほぼ同じです私形態学、マーカー遺伝子の発現とメチル化パターンのn項。 in vitroおよびin vivoアッセイにおける機能は、これらの細胞が栄養膜系譜は倍数体栄養膜巨細胞を発生させ、胚盤胞に注入された場合、胎盤をキメラ化に沿って分化することが可能であることを確認してください。体細胞組織からトロホブラスト幹細胞の誘導は、この胚体外系統の遺伝的およびエピジェネティックな特性を研究するための新たな道を開き、それぞれの胚を破壊することなくトロホブラスト幹細胞株を生成する可能性を提供しています。

4Fの導入遺伝子の発現が活性化された皿に、細胞は急速に（ 図2AおよびBを比較）の形態を変更します。一日の周りに14から21の異なる分化転換の領域は（二つの例を図2BおよびCに記載されている）出てきます。これらの一次コロニーは、典型的なTSC形態を欠いています。しかし、彼らはタイトなエッジと善意のTSCの非常に連想させる鮮やかな境界を有するサブ培養し、特徴的な上皮形態現れる（ 図2D）が一度。栄養膜転写用正4F-iTSCs染色はCdx2のとTFAP2C（ 図2E）を要因。これらITSC線は現在、in vitroまたはin vivoで 、後続のために使用することができる、 すなわち 、 インビトロ分化アッセイまたは胎盤キメラ実験を解析します。 <p class="jove_content" fo:keep-together....

ここでは、Tfap2c、Gata3、Eomes、Ets2の10日間の過剰発現により、マウス胚性線維芽細胞を完全に機能的で安定した栄養膜幹細胞に直接変換するためのプロトコルを紹介します。

Trophoblast stem cells (TSCs) arise as a consequence of the first cell fate decision in mammalian development. They can be cultured in vitro, retaining ...

この手順の全体的な目的は、マウス線維芽細胞から真正な誘導トロフォブラスト幹細胞（iTSC）を生成することです。この手法は、胚系と胚外系の分離障壁の性質に関する、幹細胞分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、導入遺伝子の発現が一時的にのみ活性化されるため、安定的に転換された細胞の選別が容易であることです。適切な個人用保護具を着用し、バイオセーフティレベル2の研究室において、5枚の100 mLディッシュに5 mLのPoly-L-lysine溶液を加え、プレートを軽く揺らしてコーティング溶液を均一に分散させます。ディッシュを37 °Cのインキュベーターに30分間置き、その後、Poly-L-lysineを吸引し、PBSで1回洗浄します。次に、1枚のディッシュあたり7 × 10⁶個の293 T細胞を10 mLの293 T細胞用培地で播種し、ディッシュを回転させて細胞を均一に分散させ、インキュベーターに戻します。翌朝、成長培地を5 mLのトランスフェクション用培地と交換します。次に、1000Xのクロロキン溶液ストックを6 µL加え、プレートを37 °Cのインキュベーターに戻します。トランスフェクション混合液を調製するため、各レンチウイルスベクターについて、2X HEPES緩衝生理食塩水600 µLにレンチベクターDNA溶液600 µLをボルテックスしながら滴下し、トランスフェクション混合液を室温でインキュベートします。15分後、混合物を調製した293 T細胞に非常に慎重に滴下し、ディッシュをインキュベーターに戻します。5〜6時間後、培地を10 millilitersのウイルス生産培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻します。翌朝、培地を7 millilitersの新鮮なウイルス生産培地に慎重に交換し、さらに一晩インキュベートします。次に、各プレートから培地を個別の15 milliliter コニカルチューブに移し、プレートに7 milliliter の新鮮なウイルス作製培地を加えて、さらに一晩インキュベートします。翌朝、2回目のウイルス含有培地を回収して上清を1回目のウイルス分と合わせ、ウイルス含有培地を0.45 micron の界面活性剤フリーセルロースアセテートメンブレンフィルターでろ過し、-80°Cで500 microliter ずつ分注して保存します。線維芽細胞を誘導多能性栄養膜細胞に変換するため、導入後のマウス胚線維芽細胞（MEF）を2 milliliter のPBSで2回洗浄します。次に、37°Cで0.5 mLのTrypsin EDTA溶液を用いて細胞を剥離させます。3〜4分後、倒立顕微鏡下で細胞がプレートから剥がれたことを確認し、1 mLのTS mediumを加えてTrypsinを不活化します。細胞懸濁液を個別の15 mLコニカルチューブに移し、細胞を遠心分離します。次に、ペレットを2 mLのTS培地で再懸濁し、線維芽細胞増殖因子4とヘパリン、およびドキシサイクリンを添加した10 mLのTS培地を用いて、100 mmディッシュあたり2 × 10⁵個のmCherry導入またはコントロールの非導入MEFを播種し、一晩培養します。翌日、エピ蛍光顕微鏡下でmCherryタンパク質の発現を確認し、導入効率を推定します。導入効率が約100%であれば、培養物をインキュベーターに戻し、10日目まで1日おきにすべてのディッシュの培地を交換します。その後、倒立顕微鏡を用いて、4つの因子を導入したディッシュ上に分化転換領域が現れるかを最大3週間監視しながら、Doxycyclineを含まず、線維芽細胞増殖因子4およびヘパリンを含む新鮮なTS培地で細胞を nuôi育します。この時点では、MEFは形態的に栄養膜幹細胞に似ていないため、分化転換領域を特定することが極めて重要です。細胞サイズと大きな核によって識別される栄養膜巨細胞に隣接した、密集して積み重なったコロニーを探してください。個々のiTSCラインを単離するために、まず倒立顕微鏡を70%ethanolで拭き、細菌汚染の可能性を最小限に抑えます。次に、96 U底ウェルプレートの12個のウェルに0.5%Trypsin EDTAを40 µLずつ添加し、プレートを氷上に置きます。続いて、4つの因子のMEF転分化ディッシュから培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を1回洗浄します。洗浄後、細胞に10 millilitersの新しいPBSを加え、プレートを倒立顕微鏡のステージ上に置きます。40 microlitersに設定した100 microliterピペットを用い、個々のコロニーの周囲をピペットチップで囲み、浮上したコロニーを吸引します。12個のコロニーをピックアップするまで、各コロニーを96ウェルプレートの個別のウェルに転移させます。次に、コロニーを37°Cで5分間インキュベートします。インキュベーション後、ピぺッティングによって細胞を解離させ、細胞懸濁液を、500 µLの完全TS＋線維芽細胞増殖因子およびヘパリン含有培地を入れた24ウェルプレートの各ウェルに転移し、一晩培養します。翌日、死細胞を除去するために培地を新鮮な完全TS＋線維芽細胞増殖因子およびヘパリン含有培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻します。上皮細胞コロニーの明瞭な境界が出現するかどうか、毎日培養液を観察します。コロニーが観察されたら、最大1週間、あるいは細胞密度が70%コンフルエントになるまで培養します。4つの因子の導入遺伝子の発現が活性化している培養物では、細胞の形態が急速に変化します。14日から21日頃にかけて、明確な分化転換領域が出現します。これらの一次コロニーは、典型的な栄養膜外胚葉幹細胞の形態を示しませんが、継代 culture すると、真の栄養膜外胚葉幹細胞を強く想起させる、境界が明瞭で辺縁が密な特徴的な上皮様形態が観察されます。4つの因子によって誘導された栄養膜外胚葉幹細胞が、栄養膜外胚葉転写因子である Cdx2 および Tfap2c に対して陽性であり続ける場合、これらの細胞株を以降の in vitro または in vivo 解析に使用することが可能です。この手法を習得すれば、適切に実施することで6週間で完了させることができます。本手順の後、生成されたiTSCのキメラ形成能に関するさらなる疑問を解消するために、ブラストアシスト注入法などの他の手法を実施することが可能です。本手法の開発により、初期胚の系統分離分野の研究者が、マウスにおける胚性細胞から胚外細胞への運命転換について探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、新しい胚性線維芽細胞を誘導トロフォブラスト幹細胞へ直接転換する方法について十分に理解できるはずです。レンチウイルスベクターを取り扱う際は極めて危険であるため、バイオセーフティレベル2に準拠した適切な作業手順などの予防策を常に遵守することを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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栄養膜幹細胞へのマウス胚性線維芽細胞の直接変換するためのプロトコル

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