Name: 質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶ UV光架橋と質量分析を用いた生細胞内RNA結合タンパク質の同定法。マウス胚性幹細胞を用いてRNA結合領域をマッピングし、エピジェネティクスにおける遺伝子制御メカニズムを解明する強力なツールです。

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R. b. は、サール学者プログラム、大戦スミス財団 (C1404) および (1-年度-15-344) ・ ダイムズ財団の 3 月によって支えられました。:Wii は、NIH からのサポートは R01GM110174 と NIH の R01AI118891 を付与し、DOD、BC123187P1 を付与を認めています。R. W. T.NIH のトレーニングの許可 T32GM008216 によって支えられました。

1。 文化と mESCs の拡大 注: マウス胚性幹細胞は文化に手軽な高速サイクリング時間のおかげで生化学的な実験に必要な大量に迅速に展開できます。健康 mESCs ダブルすべての 12 h.
37 ° c、5% CO 2、ティッシュ文化のインキュベーターで <ol><li>mESC 糊板に希望の番号を mESCs を展開中 (下記参照) を保持し、&#62; 湿度 95% 。
	注: 十分なプレートは、3-5 生物複製しのために準備されるべき、+ 4SU サンプルと 4SU コントロール。1 つ 10 cm プレート (すなわち 500 万セル) で各生物の複製よりも十分です</li>。
	<li>MESCs のための媒体はダルベッコから成る &#39; s 変更イーグル &#39; ペニシリン/ストレプトマイシン、1 x 非本質的なアミノ酸、100 μ M β-メルカプトエタノール、1,000 U x 0.5 15% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM L-グルタミンを添加した s 培地 (DMEM)/mL の白血病抑制因子 (LIF) 3 μ M CHIR99021、1 μ M PD0325901</li>。
	<li>MESCs を通過、前に 10 cm 板の必要な数を準備します。
	<ol><li>プレートの表面全体が覆われているかどうかを確かめる水に 4 mL 0.1% ゼラチンを追加 (RT) 室温で 10 分間インキュベート; ゼラチン溶液を削除します</li>。
	</ol></li> <li>通路の細胞に達するとプレートあたり 1000 万セル通常接種 ~ 48 h 。
	注: mESCs は、密なコロニーが大きくなるとプレートことはできません単分子膜 (例えば HEK293 または 3T3 細胞) における成長細胞の観察、100% の confluency に到達します。MESC プレートは ~ 50% コンフルエントと媒体の前に間違いなく黄色に変わったら継代する必要があります。
	<ol>細胞をデタッチする <li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 mM EDTA を添加した x 1 に一度密 mESC 文化とプレートを洗う DMEM に溶解した 0.05% トリプシンを追加し、5 分のためのインキュベーターにプレートを返す (37 ° C、5% CO 2 と &#62; 95%湿度).</li>
		<li>インキュベーターからプレートを削除し、上下に精力的に数回ピペッティングによる DMEM の等量と細胞を再懸濁します、</li>。
		<li>検定を使用してセルをカウントし、単一細胞懸濁液を細胞に形成を確保する (すなわち クラスターがありません)、セルの混合物 500 x g 室温で 5 分間遠心分離します。上清を除去し、1-2 の mL DMEM で細胞ペレットを再懸濁します</li>。
		<li>MESC 培地 (すなわち 〜 800,000 10 cm プレートごとのセル) で 10,000 のセル/cm 2 の密度で細胞を接種する 1.3.1 準備したゼラチン コーティング プレートを使用しています</li>。
	</ol></li></ol> 2。タンパク質の架橋 &#8211; 生細胞における RNA 相互作用 注: RNA タンパク質架橋は、写真アクティブ化可能なリボヌクレオシド アナログ 4-thiouridine (4SU) によって媒介される 4SU は内因性よりも長い吸光度の最大値。ヌクレオチド RNA; だけに組み込むことが、したがって中間波長の UVB は、選択的に架橋 RNA 蛋白質 25 , 26 を使用できます。4SU を含む RNA とアミノ酸、Tyr の報告された好みの共有結合性の架橋につながる 4SU 処理細胞の UVB 治療 Trp、Met、リシン、およびシステイン 27。
<ol><li>に記載されているステップ 1 として必要な数 10 cm プレートを展開 mESCs. 
	注: 十分なプレートは、3-5 生物複製しのために準備されるべき、+ 4SU サンプルと 4SU コントロール。1 つ 10 cm プレート (すなわち 500 万セル) はそれぞれの生物の複製のために十分</li>。
	<li>プレートの confluency に到達、前に 500 の最終的な集中に媒体に直接 4SU を追加 μ m 残す - 未処理の 4SU 制御料理</li>。
	<li>配布中で均一 4SU に優しく振るプレート。2 時間同じ培養孵卵器にそれらを返す (37 ° C、5% CO 2 と &#62; 湿度 95%).</li>
	<li>氷のバケツにプレートを転送し、媒体を破棄します</li>。
	<li>リンス 5 mL の氷冷 PBS で軽く板 。
	注: リンス優しくまたはセル可能性がありますデタッチします</li>。
	<li>は紫外線発光電球搭載架橋剤で蓋なし氷冷 PBS と場所のプレートの 2 mL を追加 (312 nm)。1 J/cm 2 のエネルギー設定で板の照射します 。
	注: プラスチック蓋が削除されますまたは彼らが紫外線から細胞を守るかもしれないし、架橋を防ぐことが重要です</li>。
	<li>は、セルは、リフターを使用して細胞を収集し、氷冷 PBS の円錐管に転送。2,000 x g で 4 ° C、5 分間遠心</li>
	<li>上澄みを除去し、2 mM EDTA、0.2 mM 特異のフッ化物 (PMSF) 5 mL 氷冷 PBS で細胞ペレットを再懸濁します</li>。
	<li>診断のセルを数える。それぞれ 10 cm と 15 cm のプレートから 5-10 と 1000 万の細胞を期待します</li>。
	2,000 x g で 4 ° C、5 分間遠心する <li> 
	注: 播種細胞すぐ使用できますステップ 3 のまたは液体窒素でフラッシュ凍結でき無期限に-80 ° C で保存します。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 3。核の隔離 注: 核は細胞質蛋白質を削除および核蛋白質のカバレッジを高めるから切り離されています。この手順は、別の細胞コンパートメントに Rbp を勉強する細胞分別の他の形態と置き換えることができます。
<ol><li>準備氷冷バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.9, 4 ° C、MgCl 2、1.5 mM 10 mM KCl)。(カウント 2.9 の手順で) 1000 万の細胞あたり少なくとも 2.5 mL、抽出に使用します 。
	注: バッファー A の在庫 (例えば 500 mL のボトル) することができます事前に準備、6 ヶ月のための 4 ° C で保存します。
	<li>使用前に 0.5 mM ジチオトレイトール (DTT) と 0.2 mM PMSF 冷たいバッファー A. の希望の金額 (1000 万セルあたり 2.5 mL) を追加</li> <ol>
	</ol></li> <li>1000 万セルあたり 2 mL バッファー A を使用してセルを洗浄します。4 ° C で 5 分間 2,500 x g でスピン</li>
	<li>破棄清追加バッファー オクチル フェノキシ polyethoxy エタノールなど、非イオン性、非変化洗剤の 0.2% を添加した A (材料の表 を参照)、1000 万セルごと 500 μ L。4 ° C で 5 分間回転</li>
	<li>2,500 x g で 5 分間遠心分離</li>
	上澄みを除去 <li>; ペレット細胞質を欠いてそのまま核で構成されています 。
	注: 核することができます手順 4 または液体窒素でフラッシュ凍結のためすぐに使用し、無期限に-80 ° C で保存します。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 4。核の溶解 注: 架橋核タンパク質とタンパク質・ RNA 複合体を解放する質量分析法と互換性のあるバッファーで分離が。
<ol><li>追加換散バッファー (9 M 尿素、100 mM トリス塩酸 pH 8.0、24 の ° C)、1000 万セルあたり 200 μ L。1/8 を使用してクロマチンをせん断する超音波 &#34; 5-10 の 50% 振幅設定でプローブ</li>
	ペレットを避けるために清の <li>スピン 12,000 × g で 5 分で収集 175 μ L. 
	注: RBR ID、次の手順のため 100 μ L が使用され、後で使用および/または西部のしみの分析-80 ° C でライセートの残り 75 μ L を格納できます</li>。
	<li>ブラッドフォードの試金または類似の技術 28 を介して測定蛋白質の集中。1 mg/mL に異なるサンプルの蛋白質の集中または換散バッファーの適切な量を使用して最低のサンプル濃度を希釈します 。
	注: 1000 万 mESCs の核から蛋白質の 100-200 μ g を期待します</li>。
</ol> 5。トリプシンの消化力 注: ペプチド s を生成するタンパク質が消化されてルータ ボトムアップ型質量分析法 (MS) 分析のために適しています。
<ol><li>室温 1 時間孵化させなさい核溶解 (5 mM 最終); に DTT の追加ソリューション</li>
	<li>新鮮な在庫 (最終的な 14 mM) からヨードアセトアミドを追加; 暗闇の中室温で 30 分間インキュベートします</li>。
	<li>5 倍量の 50 mM NH 4 HCO 3 lysate Dilute</li>
	<li>トリプシンを追加 (μ g タンパク質: μ g トリプシン = 200:1); 37 ° C で一晩インキュベートします</li>。
</ol> 6。ペプチドの脱塩 <ol><li>サンプルあたり 1 つのカスタムメイド ステージ先端の準備します。
	<ol><li>6.1.1 200 μ l ピペット チップの底に固相抽出 C18 材料のディスクを配置します。</li>。
		<li>追加 50 μ L オリゴ R3 の逆相 C18 ディスク上に樹脂になります。遠心分離アダプターの内部ステージ ヒントと場所の先端 1.5 mL および microfuge の管の内部アダプターを配置します</li>。
		<li>追加 100 μ L 100% アセトニ トリルを洗うのヒントに。溶媒を削除する 1 分 1000 × g で遠心する</li>。
		<li>Equilibrate 50 μ L 0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)。1000 × g で 1 分間遠心</li>
	</ol></li> <li>100% ギ酸を 2-3 に pH が低下する消化された蛋白質のサンプルに追加します 。
	注: これは希釈ペプチド試料 1 mL あたり 〜 5 μ L 必要が、pH は測定しよりギ酸の追加をする必要があります必要に応じてします</li>。
	<li>特注ステージ ヒント、1000 × g で遠心するサンプルのすべてまで 1 分の上にサンプルをロードし先端を通過します</li>。
	<li>洗浄結合ペプチドの 50 μ L 0.1 %tfa。1000 × g で 1 分間遠心</li>
	<li>50 μ L の溶出バッファーを追加してペプチドの溶出 (75% アセトニ トリル、0.025 %tfa) ステージの先端と先端から溶出バッファーを強制的に 1 分 1000 × g で遠心する</li>。
	<li>乾燥 150 x g と 1 のための 1-3 kPa で設定真空遠心分離機を使用してサンプル 
	注: 乾燥ペプチドが-80 ° C で不明確に保存されます。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 7。架橋 RNA の除去 注: 架橋 RNA を削除するヌクレアーゼのペプチドを扱う。
<ol><li>50 μ L 2 ヌクレアーゼ バッファー (100 mM NH 4 HCO 3、4 mM MgCl 2) x でペレットを再懸濁します</li>。
	280 吸光度を用いた <li>メジャー ペプチド濃度 1 の A 280 のペプチドの 1 mg/mL と仮定すると nm 。
	注: 予想される濃度が 1 mg/mL</li>。
	<li>すべてのサンプル 1 mg/mL、ヌクレアーゼ バッファー x 2 を使用して最低の濃度を調整します</li>。
	<li>50 μ L H 2 O + 1 μ L 高純度ヌクレアーゼのマスター ミックスを調製 (&#8805; 250 U) (材料の表 を参照してください) サンプルあたり</li>。
	<li>ペプチドのサンプルの 50 μ L を取り、50 μ L H 2 O の + ヌクレアーゼ マスター ミックスを追加します</li>。
	1 h. 質量分析を実行する続行の 37 ° C に加温 <li>. 
	注: ペプチッドは質量分析の準備が整いました。彼らは、すぐに解析または無期限に-80 ° C で保存できます。これは潜在的なポイントを停止します</li>。
</ol> 8。ナノ液体クロマトグラフィー、質量分析法、および Raw データ現像処理 注: 4SU 架橋ペプチドの質量が変更されるため、イオンはカウントされません非架橋ペプチドの強度 LC ・ MS/MS 中、したがって、架橋によって減るべきなら表示されます。程度と減少の一貫性の各ペプチド 24 タンパク質-RNA 架橋度を反映している。
<ol><li>次のようにバッファーの準備高速液体クロマトグラフィー: HPLC 級水 (バッファー A) の 0.1% ギ酸; 高速液体クロマトグラフィー用アセトニ トリル (バッファー B) の 0.1% ギ酸</li>。
	<li>ナノ高速液体クロマトグラフィーが利用できない場合は以下の仕様のナノ列を接続: 内部直径 75 μ m 充填 C18 AQ 粒子; 長さ 20-25 cm 。
	注: 高速液体クロマトグラフィーを利用できる高い流動度で実行されている場合は、指定された流量の適切な列サイズを使用します。高い流れクロマトグラフィー感度が低下します</li>。
	<li>は高速液体クロマトグラフィー法を次のようにプログラム: フロー レート 250 300 nL/min; 2 から 120 分で 80 %b 次の 5 分、10 分のイソクラティック 80% B 28 から 28% バッファー B へのグラデーション 
	注: HPLC に自動列の平衡事前サンプル読み込みがあるない場合プログラムを起動 0 %b で 10 分間のサンプルをロードする前にします</li>。
	<li>は、MS 獲得手法として標準的な散弾銃プロテオミクス実験データ依存型獲得 (DDA) を実行するプログラムします。楽器デューティ サイクル タンデム MS スキャン (MS/MS) 信号の最も激しいの MS フルスキャンを代替する必要があります。最適な設定を使用して、実行する MS プロテオミクス 。
	注: 自信を持って結果を得るのため、少なくとも完全 MS を実行できます使用楽器は高解像度モード (例えば orbitrap、飛行時間) でスキャンします。正確な定量化のためフルスキャン MS 間の間隔は、もはやよりも 3 s. 長くデューティ ・ サイクルは、抽出したイオンのクロマト グラムの正確な定義をできない可能性があることを確認します</li>。
	<li>は、HPLC カラムにサンプルの 1-2 μ g を読み込み、プログラム、高速液体クロマトグラフィー/タンデム質量メソッドを実行します。各生物の複製のために少なくとも 2 つの独立した実行し、技術的複製を扱う</li>。
	<li>後 MS は、MS/MS スペクトル同定及び抽出したイオンクロマトグラフィーによるペプチド定量化のプロテオミクス ソフトウェア パッケージに raw ファイルをインポートします。複数のクロマト グラフの配置を実行することができますソフトウェア パッケージをお勧めします MS (参照 材料表) 29 , 30 を実行します</li>。
	<li>オプションのソフトウェア スイートで利用可能な場合を有効にする &#34; マッチの間実行 &#34; データ処理を開始する前にします</li>。
	<li>分析が完了すると、定量値と共にペプチド リストをエクスポートします</li>。
</ol>

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MESCs と、4SU の RNA を組み込むことができます任意のセルに、適切な修正と RBR ID を実行する詳細な実験的プロトコルについて述べる。他の細胞型は、十分な信号対雑音比を確実にとる方法の最適化を必要があります。さらに、プロトコルは、核 Rbp の検討に焦点を当ててを記載、一方 RBR ID 技術は異なる分別法による細胞質または特定の細胞小器官などの異なる細胞コンパートメントに容易に適応する必要があります。戦略。最適化が必要な可能性がありますパラメーターは、UV 架橋のエネルギーと同様、4SU の濃度と時間に含まれます。これらのパラメーターは、RNA タンパク質クロスリンクの効率的な形成を確保し、良好な信号対雑音比をもたらすに重要です。312 nm 紫外線光は、365 と比較して 4SU を含む Rna タンパク質架橋ではるかに効率的な示されている nm パー クリップ32で通常使用される UVA。312 と RBR ID の比較を直接 nm、365 nm を発揮する 312 nm UVB は知られている Rbp24の大部分の特定...

RBR ID メソッドの目的は、新規 RNA 結合タンパク質 (Rbp) を識別し、RNA 結合変異体のデザインと生物学的・生化学的研究を促進するペプチド レベルの解像度とその RNA 結合領域 (RBRs) を割り当てるには蛋白質と核酸の相互作用の機能。
RNA は、遺伝情報を運ぶメッセンジャーとして行動することができも折る蛋白質1,2のものに似ている生化学的機能を持つ複雑な三次元構造、生体分子間で一意です。証拠の成長するボディは、Rna (ncRNAs) は様々 な遺伝子規制およびエピジェネティックな経路3,4,5で重要な役割を果たすし、コンサートでこれらの規定する機能を仲介する通常、示唆しています。具体的には特定の RNA と相互作用する蛋白質。特定の関連性の相互作用の蛋白質のセットは激しく勉強長い ncRNA (lncRNA) この lncRNA が女性の細胞6,7 における x 染色体不活性化に仲介する貴重な洞察を提供する Xist の最近確認されました。 ,8。とりわけ、Xist と相互作用するタンパク質のいくつかの標準的な RNA 結合ドメイン9が含まれていない、したがって、RNA 結合活性予測できなかったインシリコ単独で主なシーケンスに基づいています。LncRNAs の何千もが任意の特定のセルの10で表されることを考えると、それは、それらの多くを RNA 結合タンパク質 (Rbp) が発見される、まだ行動との相互作用を介して可能性がありますと仮定するが妥当。これらの新しい Rbp を識別する実験的戦略 ncRNAs の生物学的機能のタスクが大いに促進したがって。
経験的 Rbp を識別する以前の試みは、polyA + 質量分析法 (MS)11,12,13,14,15と結合した RNA 選択に頼ってきました。これらの実験は、デザイン polyadenylated 成績証明書にバインドされているタンパク質を検出できるだけで推定 Rbp のリストに多くの蛋白質を追加。ただし、ほとんどの小さな Rna と多くの lncRNAs は polyadenylated ではありません。16,17との相互作用の蛋白質が可能性が見逃しているこれらの実験で。最近の研究では、複数の知られている Rbp と精製には共同、これら再発 RBP パートナーの RNA 結合活動18を持っている可能性が高いを示した蛋白質を識別するタンパク質インタラクトーム データベースに機械学習を適用されます。ただし、この方法は、既存の大規模な相互作用データベースのマイニングに依存し、共同知られている Rbp、不溶性、膜に埋め込まれて、希少な解析から除いたと非変化条件で精製することができます蛋白質を識別することができますのみ蛋白質。
しばしばbona fide RBP としてタンパク質の同定はタンパク質-RNA 相互作用の生物学的・生化学的機能に関する情報を自動的に生成しません。この点に対処するため、それは通常各小説 RBP19、のコンテキストで RNA 結合の関数をテストする特定の変異体を設計できますように蛋白質のドメインとアミノ酸の相互作用に関与する残渣を識別することが望ましい20. 私達のグループと他の前の努力は RNA 結合領域 (RBRs)19,20,21,22; を識別する組換えタンパク質断片と欠失変異株を使用しています。ただし、このようなアプローチは手間と高スループット解析と互換性がありません。最近では、研究が質量23; を使用して高スループット方法で RNA 結合アクティビティにマップする実験的戦略を説明ただし、このアプローチはダブル polyA + RNA 選択に頼った、従って上記 RBP 同定アプローチと同じ制限を実施します。
光架橋蛋白質 RNA と蛋白質とことがなく生細胞における RNA と相互作用するタンパク質領域を識別するために定量的質量分析を利用する RNA 結合領域識別 (RBR-ID) と呼ばれる手法を開発RNA の起こる状況を想定、こうして Rbp を含む polyA Rna24にバインドされています。また、このメソッドは架橋に専ら依存しているとタンパク質溶解度またはユーザー補助の要件を持たないし、膜 (例えば核封筒) または難溶性コンパートメント (内 RNA 結合アクティビティをマッピングに最適です。例えば核マトリックス)。マウス胚性幹細胞 (mESCs) の核の RBR ID の実験手順について述べるが、マイナーな修正とこのプロトコルに適しているべき様々 な細胞の種類、彼らは効率的に文化から 4SU を組み込むことができますされます。媒体。

<table><tbody><tr><td>ノックアウトDMEM</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、認定、米国原産</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液 200 mM</td><td>シグマ</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>シグマ</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100回;)</td><td>シグマ</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO白血病抑制因子(LIF)</td><td>EMDミリポア</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>トクリス</td><td>4423</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>シグマ</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン溶液、水中2%</td> シ<td>グマ</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-チウリジン</td><td>シグマ</td><td>T4509</td><td>50 mM水のストック</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>フェニルメタンスルホニルフッ化物</td><td>シグマ</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>シグマ</td><td>542334</td><td>オクチルフェノキシ-ポリエトキシ-エタノール洗剤の商業形態</td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>シグマ</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、シーケンシンググレード</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore 固相抽出ディスク</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 逆相 樹脂</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>ベンゾナーゼ</td><td>シグマ</td><td>E8263</td><td>高純度ヌクレアーゼ</td></tr><tr><td>ソニック ディスメンブレーター モデル 100</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>製造中止</td><td>FB505110</td></tr> <tr><td>で更新されましたHPLCグレードのアセトニトリル</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Σ</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>シグマ</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td> ナノカラム用<td>HPLCカラム</td></tr><tr><td>キャピラリーの充填剤(75 & micro;m)</td><td>Molex</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuantソフトウェア</td><td>Max Planck Institute for Biochemistry</td><td></td> 複数の<td>MSランのクロマトグラフィーアライメントを行うことができます</td></tr></tbody></table>

質量分析を用いた識別 rna 結合領域のための試料作製

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Rna は、遺伝子発現、クロマチン構造と DNA 修復を規制を含むいくつかの核プロセスで重要な役割を果たします。ほとんどの場合、非翻訳 Rna のアクションは蛋白質の機能が Rna とこれらの相互作用によって規制されて順番によって媒介されます。これと一致して、増えて核機能に関与するタンパク質の RNA をバインドする報告されているし、いくつかのケースでこれらの蛋白質の RNA 結合領域マップされている、多くの場合骨の折れる、候補者ベースのメソッドを使用します。
ここで、RNA 結合タンパク質と RNA 結合領域の高スループット、プロテオーム的公平な識別を実行する詳細なプロトコルを報告します。方法論は、光反応性ウリジン細胞 RNA、蛋白・ RNA の UV を介した架橋と質量分析に続いて、プロテオーム内 RNA 架橋ペプチドを明らかにするためにアナログの取り込みに依存しています。マウス胚性幹細胞のための手順を説明する、プロトコルは、簡単にさまざまな培養細胞に適応する必要があります。

図 1は、RBR ID ワークフローを示しています。この手法の比較的低い架橋効率のため生物学的複製間で枯渇レベルと観測の効果 (P値) の一貫性の両方を考慮する非常に重要です。図 2は、RBR ID の結果の火山プロットを示しています。RNA 認識モチーフ (RRM) ドメインをオーバー ラップするペプチドは、非常に一貫した枯渇のレベルを表示します。RRM のドメインは、RBR ID 分析用ポジティブ コントロールとして使用できます。
RBR ID は生きているセルで RBRs にマップする使用できます。各ペプチド RNA 結合のポテンシャルを推定する RBR ID スコアを計算できます: RBR ID スコア = -2対数 (正規化された 4SU 強度/正規化 + -4SU 強度) (ログ<s...

RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA 結合領域をマップするためのプロトコルについて述べる。

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

この手順の全体的な目的は、UV照射による光架橋法とそれに続く質量分析を用いて、生細胞内のRNA結合タンパク質を同定し、そのRNA結合領域をマッピングすることです。この手法は、どのエピジェネティック制御因子がRNAに結合しているか、また相互作用にどのタンパク質領域が必要かなど、エピジェネティクス分野における重要な疑問の解決に役立ちます。この技術の主な利点は、タンパク質-RNA複合体の精製を必要としないため、少量の試料で実施でき、あらゆる種類のRNAに結合したタンパク質を同定できることです。本手法では、我々の研究目的である核タンパク質に焦点を当てていますが、分画ステップをわずかに変更することで、他の核内コンパートメントにおけるRNAおよび結合タンパク質の研究にも利用可能です。テキストプロトコルに従ってマウスESCを培養・拡大させた後、細胞を必要数の10 centimeterプレートに播種して拡大させます。プレートがコンフルエントになる前に、500 micro molarの最終濃度になるよう、4-SUを培地に直接添加します。4sUコントロールディッシュは未処理のままにします。プレートを静かに揺らして、培地全体に4sUを均一に分散させ、その後、同じ組織培養インキュベーターに2時間戻します。4sUの取り込み効率は細胞型によって異なるため、効率的な架橋を確保し毒性を最小限に抑えるために、濃度とインキュベーション時間を最適化する必要がある場合があります。次に、プレートを氷入りのバケットに移し、培地を捨てます。その後、5 millilitersの氷冷PBSを用いてプレートを穏やかに洗浄します。2 millilitersの氷冷PBSを加え、蓋を外した状態でプレートをUV-B照射ランプを備えたクロスリンカーに入れます。1 Joule/cm²のエネルギー設定でプレートに照射します。効率的なUV架橋が極めて重要です。UV-B光の使用を推奨しますが、UV-Aも使用可能です。いずれの場合においても、使用するUVエネルギー量は最適化されるべきであり、PAR-CLIPまたはChIRPによってモニタリングが可能です。セルリフターを用いて細胞を回収し、コニカルチューブに入った氷冷PBSに転送します。その後、細胞を2000 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。上清を除去し、2 mM EDTAおよび0.2 mM PMSFを含む氷冷したPBS 5 mLで細胞ペレットを再懸濁します。血球計数計を用いて細胞数を計測してください。10 cmプレートからは500万〜1,000万個、15 cmプレートからは1,000万〜2,000万個の細胞が得られる見込みです。次に、細胞を2000 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。細胞から核を単離するために、テキストプロトコルに従って氷冷した緩衝液Aを準備します。使用前に、必要な量の緩衝液Aに0.5 mM DTTおよび0.2 mM PMSFを加えます。細胞を洗浄するために2 mLの冷緩衝液を加え、2500 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。上清を捨て、0.2%の非イオン性非変性界面活性剤を添加したバッファーAを加え、サンプルを4 °Cで5分間回転混和させます。細胞を2500 ×gで5分間遠心分離した後、上清を除去します。このペレットは、細胞質を含まない無傷の核で構成されています。核を溶解させるため、チューブに200 µLの溶解バッファーを加えます。1/8インチのプローブを用い、振幅設定50%で5〜10秒間サンプルの超音波処理を行い、クロマチンを剪断します。サンプルを12000 ×gで5分間遠心分離し、ペレットを避けて上清のみを175 µL回収します。次に、ブラッドフォード法または同様の手法でタンパク質濃度を測定します。その後、溶解バッファーを用いて、各サンプルのタンパク質濃度を1 mg/mLまたはサンプル中の最低濃度まで希釈します。核ライセートに5 mM DTT溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。次に、新調したストックから14 millimolarのヨードアセトアミドを添加し、ライセートを室温の暗所で30分間インキュベートします。ライセートを50 millimolarの炭酸水素アンモニウムで5倍量に希釈し、トリプシンを添加します。サンプルを37 degrees celsiusで一晩インキュベートします。サンプルあたり1本のカスタムステージチップを調製するために、200 µLのピペットチップの底部に固相抽出C18材料のディスクを配置します。C18ディスクの上に50 µLのOligo R3逆相樹脂を加え、次にステージチップを遠心アダプターに入れ、そのアダプターを1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れます。チップを洗浄するために、100 %アセトニトリルを100 µL加えます。次に、チップを1000 ×gで1分間遠心分離し、溶媒を除去します。0.1% トリフルオロ酢酸（TFA）を50 µL加えて、チップを平衡化させます。その後、再度遠心分離を行います。消化したタンパク質サンプルに100%ギ酸を加え、pHを2から3まで下げます。次に、サンプルを自作のステージチップにロードし、サンプルがすべてチップを通過するまで1000×gで1分間遠心分離します。結合したペプチドを50 µLの0.1% TFAで洗浄します。次に、サンプルを1000 ×gで1分間遠心分離した後、ステージチップに50 µLの溶出バッファーを加え、1000 ×gで1分間遠心して溶出バッファーをチップから押し出し、ペプチドを溶出させます。真空遠心機を150 ×g、1〜3 kPaに設定し、1時間かけてサンプルを乾燥させます。サンプルから架橋されたRNAを除去するために、ペレットを50 µLの2x ヌクレアーゼバッファーで再懸濁します。1 mg/mLのペプチドのA280が1であると想定し、280 nmでペプチド濃度を測定します。2xヌクレアーゼバッファーを用いて、すべてのサンプルを1 mg/mLまたは最低濃度に調整します。次に、サンプル1つあたり50 µLの水と1 µLの高純度ヌクレアーゼを加えたマスターミックスを調製します。50 µLのペプチドサンプルと、50 µLの水およびヌクレアーゼを含むマスターミックスを混合します。次に、サンプルを37 °Cで1時間インキュベートします。最後に、テキストプロトコルに従って、ナノ液体クロマトグラフィー、質量分析、およびデータ処理を行います。この図は、マウスESCからのRBR id結果のボルケーノプロットを示しています。RNA認識モチーフドメインと重複するペプチドは青色で示されており、非常に一貫した減少レベルを示しています。HNRNPC由来のRNA結合ペプチドは赤色でハイライトされています。ここでは、タンパク質領域のRNA結合の可能性の推定値として算出されたRBR idスコアのヒートマップを示します。スコアはスプライソソームサブユニットU1-70kの表面に投影されています。結晶構造によって決定されたRNA接触部位付近の明るい赤色は、タンパク質とRNAの相互作用が正しく同定されたことを示しています。この図では、TET2が新規のRBPとして提示されており、タンパク質の一次配列に沿ってRBR idスコアをプロットすることで、RNA結合活性がC末端領域にマッピングされています。最後に、この新規RBRの必要性は、野生型配列を用いてPAR-CLIPを行い、そのシグナルを予測されるRBRを欠損させた変異体と比較することで検証できます。習得すれば、適切に実施した場合、この手法は2日間で計7〜8時間で完了します。架橋させる前に、細胞にさまざまな処理を施して刺激することで、分化がどのように開始されるか、あるいは細胞周期がRNA-タンパク質相互作用をどのように制御しているかといった、さらなる疑問に対する検討が可能です。このビデオを視聴することで、質量分析を用いてタンパク質-RNA相互作用部位を特定するための、架橋タンパク質-RNA複合体を含む抽出物を調製する方法について十分に理解することができます。

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

RNA転写物は、トランス作用RNA結合タンパク質（RBPs）の多数によって媒介される大規模な転写後調節の対象となります。ここでは正確にとトランスクリプトーム全体の規模でRBPsのRNA結合部位を同定するために一般化の方法を提示する。...

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

このビデオでは、目的の標的タンパク質の特定のRNA結合配列を特定するための指数関数的濃縮(SELEX)法によるリガンドの系統的な進化について説明します。タンパク質は、ランダム化されたRNA配列の大規模なプールとインキュベートされ、タンパク質結合RNA配列は単離され、PCR増幅され、それらのタンパク質結合部位を同定するために配列決定されます。...

RNA-タンパク質相互作用を同定するためのSELEXベースのIn Vitro結合アッセイ

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配列特異性は遺伝子調節に不可欠です。特定の配列を認識する調節タンパク質は、遺伝子調節にとって重要です。このようなタンパク質に対する機能的結合部位の定義は、困難な生物学的問題である。RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための反復的アプローチをここに説明し、すべてのRNA結合タンパク質に適用可能である。...

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我々は、標準的な方法よりもバイアスが少ない詳細な小さなRNAライブラリー修復プロトコルと2'-O-メチルRNAの感度の増加を提示する。このプロトコルは、コストを節約するために自家製試薬を使用するか、便宜上キットを使用して従うことができます。...

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2D-HELS MS Seq:異なるヌクレオチド修飾を持つRNA混合物の直接およびde novoシーケンシングのための一般的なLC-MSベースの方法

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グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

このプロトコルは、突然変異プロファイリング実験のために硫酸ジメチルでRNAを修飾するための指示を提供します。これには、2つの代替ライブラリ調製方法を使用したin vitro および in vivo...

硫酸ジメチルによるRNA構造のプロービング in vitro および細胞内でのシーケンシングによる突然変異プロファイリング(英語)

学ぶ UV光架橋と質量分析を用いた生細胞内RNA結合タンパク質の同定法。マウス胚性幹細胞を用いてRNA結合領域をマッピングし、エピジェネティクスにおける遺伝子制御メカニズムを解明する強力なツールです。

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

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