Name: 胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶNasonia vitripennis胚のマイクロインジェクション手法。ゲノム操作と遺伝子改変を可能にし、毒液産生や性決定の研究に応用できます。

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この作品は、寛大なカリフォルニア大学リバーサイド (UCR) 研究室のスタートアップ資金を米国農務省国立食品研究所、農業 (NIFA) ハッチ プロジェクト (1009509) O.S.A. と O.S.A によって支えられました。

1. N. Vitripennisコロニー飼育
<ol>
	<li>いくつかの植民地を設定 (~ 3-5) バグ寮ケージで 200-500名 vitripennis大人 (女性: 男性の比率は 3:1) を配置することによって。 注: バグ寮、ハチを使用する代わりには、約 15-20 ハチ/バイアルと綿と差し込まれる複数の小さなガラスの試験管にも反映できます。<ol>
		<li>25 ± 1:10 (v/v) の小さな液滴と毎日を餌付け 1 ° C 相対湿度 30% と 12:12 ライト暗い周期のスズメバチを維持/スクロース水溶液。 注: 制御湿度; しなくても室温でハチのコロニーおよびコレクションの伝搬を実施もできます。ただし、温度は 25 ° C、胚の発育のタイミングを少し下げるよりも低い。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射前に、少なくとも 4 日間チームメイトにハチを許可します。<ol>
		<li>最初の 2 日間、新鮮な餌に雌成虫の交尾を許可する小さな水滴、1:10 (v/v) と同様に米 bullataの蛹、スクロース/水溶液。</li>
		<li>次の 2 日間、非常に妊娠し、産卵サイトの女性のハチを奪うにハエの蛹を削除します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2 収集・ n. Vitripennis前胚胚の配置
<ol>
	<li>寄生しているハチを女性を許可する (胚プレハブハウス) 若いホスト (S. bullata蛹)。ホストを新鮮に保つには、すぐにそれらを取得した後、4 ° C でホストを格納、必要な場合のみ削除します。 注: 古い計算機がある暗い色の蛹殻 (図 1 a) に対し、赤い色の蛹殻を持っていることによって若いホストを決定できます。<ol>
		<li>個々 の新鮮な米 bullataを配置蛹サイズの孔を有する発泡ストッパーに蛹を中心にカットします。のみを公開 〜 寄生状況と簡単に胚のコレクションの最大濃度のホストの前方終わり (最寄りの産卵部位) の 0.2 cm。 注: 後端が厚く、クレーターのような開口部 (図 1 b) が含まれている間、前方は丸められます。</li>
		<li>ケージにこの配置でホスト蛹 (100 ハチあたり大体 5 蛹ホスト)、約 45 分 (図 2- ii) それらに寄生するハチを許可するを待ちます。 注: それは胚内にあること、できるだけ若いと理想的な前胚の段階であることを確認、頭中の最初の 1 時間は非常に重要です。古い胚 (&#62; 1.5 h) 注入いないする必要があります。</li>
		<li>手で、優しくブラッシング/吹居住アシナガバチそれらを取得することによって寄生ホストを削除します。後新鮮なホストに置き換えてすべて 〜 15 分早く注射の中に卵をステージング収集を続けます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手でケージから新鮮な寄生のホストを削除します。(名) vitripennis卵 (図 2- iii) を公開する外装囲蛹 (さなぎシェル) の後端 (0.4 cm) 離れて鉗子を使用して解剖顕微鏡の下で慎重に皮します。 注: する必要があります注意蛹皮膚を刺さないようにこの場合、体液はマイクロインジェクションを削除する非常に困難になりますハチの胚を湿らせます。</li>
	<li>胚配置スライド (図 3) を準備するのにきれいなガラスのスライドに coverslip を接着するのに液体接着剤を使用します。 注: 高性能瞬間接着剤の接着強さの向上に使用し、乾燥スピード、しかし、coverslip のスライドの移動を防ぐことができる任意の接着剤は許容されます。</li>
	<li>払落しウェット ファイン ・ チップ絵筆で慎重にホストの柔らかい蛹肌を傷つけないようにホストから胚。 注: ' 胚を選んで、「絵筆の代わりに使用できる超微細鉗子のペアの半分本質的にであります。</li>
	<li>転送 〜 20 胚 1 つをスライド、ウェットの絵筆でカバーガラスの側に隣接。胚の後部の端が同じ方向 (図 2- 4) で指摘したように、カバー スライドのエッジに対して胚の前方の端に合わせます。これは高精度のすべての胚の間で同じ位置に注入することのなります。 注: この改善方法は、スライド21,22を前述のように胚を修正するための両面粘着テープを必要ありません。さらに、胚を脱水しないまたはN. vitripennis胚マイクロインジェクション22は前述のように射出時ハロカーボン油で卵を覆います。</li>
</ol>
3 薬剤の針の準備
<ol>
	<li>針の引き手にアルミノケイ酸塩毛細管ガラスを配置します。 注: 良い針が成功; vitripennisの重要な胚注射。注射針は、シャープとファイン ・ チップ絨毛膜を介して簡単に侵入する必要があります。また毛細血管は石英、ホウケイ酸針をすることができます (図 4) を使用します。</li>
	<li>針の引き手の 70、および 500 に圧力に 605 に熱、速度130、80 に遅延、プルを設定します。 注: 追加針引き手設定石英、ホウケイ酸針を引っ張るためのテーブル 1を見ることができます。パラメーターは、別の引き手とフィラメントのため異なる場合があります。</li>
	<li>正しい針を作成する針の引き手をアクティブにします。複数針の生産に必要なを繰り返します。 注: いくつかの平行巻商業モデラーの粘土を含んでいるペトリ皿にそれらを配置することによって引っ張られた針を格納できます。</li>
	<li>少しダイヤモンド研磨プレート約 10 に先端を触れることにより、針の先端の面取り 25 ° C (図 2- iii) で s。 注: 注射針の針を介して同時に摂政の流れを高めながら最小限のダメージで胚への参入を促進することにより面取り恩恵します。</li>
</ol>
4. 胚マイクロインジェクション
<ol>
	<li>(例えばトランスポゾン + ヘルパー トランスポザーゼまたは CRIPSR 試薬等)、ゲノム修飾試薬から成る注入混合物を準備し、氷の上にそれを維持します。</li>
	<li>2 μ L 注入混合物のと注射針をロードするには、microloader のヒントを使用します。 注: プロトコルに示す注入混合物から成ってシングル ガイド RNA (sgRNA) (s) と組換え Cas9 蛋白質混合 H2o.</li>
	<li>複合顕微鏡のステージ上に並んでの胚をガラス スライドを配置します。</li>
	<li>注意深く鉛直角の 25 から 35 ° で胚の後部の端に針を挿入します。</li></ol>注入混合物 (胎児のボリュームの約 2-10%) の 1-5 pL を挿入して胎児が少し膨らむように混合物が注入される (図 2- iv) に表示されていることを確認します。 注: あまり注入混合物は胚に注入される場合それは、解消する胚から細胞質をバーストがあります。さらに、不適切なベベルまたは針が大きすぎて壊れて開口部は、胚の破壊を引き起こす可能性があります。<ol>
		<li>目詰まりが発生した場合は、針の再面取りをしてみてください。(名) vitripennis胚の細胞質が異常に粘性、粘着性がある、頻繁に針の目詰まり (1/25 注射) に 。 注: 定期的に絵筆を使用して脱イオン水を追加して注入期間中に胚を湿った保つこと重要です。ブラシの水の量は、胚を移動し、使いやすさに合わせて鍵です。あまりにも多くの水結果胚浮動と少なすぎる水はそれらを移動にくくなります。</li>
		<li>注入 ~ 時 (約 10 分を取る必要があります)、20-40 個の卵を停止します。注入された卵に軽く触れることによってぬれた絵筆で注入された卵を転送し、ホストにそれらを置きます。卵のバッチを置いた新しく新鮮なを使用して再度注入を続行 (&#62; 1 h 古い)。 注: 理想的にはこのプロトコルは、最も効果的な一人は継続的に収集し、卵を並べる場合は、別の人はゲノム修飾成分を注入することでホスト蛹に注入された胚を移植します。</li>
	</ol>
	

5. 注入G0を Pre-stung ホスト名 vitripennis胚の移植
<ol>
	<li>以前刺されたS. bullataに挿入された G0胚を慎重に配置マイクロインジェクション後ウェット絵筆で蛹 (図 2- 6)。 注: マイクロインジェクションの胚を収集するために使用されるホスト蛹はこの目的のために動作します.また、多大な努力にもかかわらず現在ありません使用22をすることができます利用の人工飼料。<ol>
		<li>人口過密や幼虫の競争を避けるために事前に刺された単一のホストに同時に最大 40 注入された胚を 1 つを配置します。 注: インジェクションが発生; 胚に損傷不注意なホスト蛹に注入された胚移植可能性があります挿入されたコンポーネントまたは、卵黄を絞るし、胚の死に 。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>湿ったフィルター ペーパーとコットン ボール、ペトリ皿にホスト蛹を置き、注入された胚孵化 (約 1-2 日) まで湿度 70% 約 25 ° C でそれらを孵化させなさい (図 2- vii)。 注: 重要なは、ホストをおくことも可能で、皮をむいた蛹殻からN. vitripennis卵正常に成長するので乾燥を防ぐため加湿チャンバー (湿ったフィルター ペーパーと脱脂綿を敷いたペトリ皿) で孵化させます。湿度を制御することはできない場合湿らせたコットン ボールから湿度と室温でインキュベートで十分です。</li>
	<li>G0胚孵化後、湿度 70%、25°C で新しいペトリ皿にホスト蛹を転送します。<ol>
		<li>ホスト蛹と注入された G0幼虫を毎日監視します。ホスト蛹が悪臭を有すれば、新しい健康的なホスト蛹に注入された幼虫を転送します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6 ゲノムの変更のためのスクリーニング
<ol>
	<li>細かいペイント ブラシまたは胚選択のいずれかを使用してホストから各N. vitripennis蛹を削除します。注入された G0幼虫は、注射後約 8 日を蛹する必要があります。</li>
	<li>場所各削除孤立したバイアルさなぎは綿と差し込まれ、G0大人、孵化した女性が処女ことの確保として浮上することができますは、下流遺伝子交雑しやすくなります。 注: 女性並べ替えることができます男性から翅長: 女性が体のプロフィールをオン側に過去を拡張する長い翼を持っています。接続のバイアルにすべて microinjected 雌蛹を一緒に置くことが、同じオスの蛹に適用します。</li>
	<li>羽化、または視覚的にいずれかの PCR による後の画面 G0個人 (場合、表現型の遺伝子を中断)。たとえば、CRISPR を使用して特定の遺伝子の削除を作成し、破壊された遺伝子を付与する目に見える表現型、並べ替えて、影響を受ける表現型 (図 2- viii) の突然変異体のバージョンを持つ個人を維持21。場合、ただし、影響を受けた遺伝子が重要な遺伝子の変異など、非可視表現型のエンコードを回復し画面の交差方式 (クロス G0野生型女性と男性またはクロス G0野生型男性と女性) を実行します。致死または不妊の試金による遺伝的変異体。 注:キイロショウジョウバエ、 N. vitripennis大人のようを簡単な操作を可能にする CO2の露出によって固定することができます。また、つがいでない雌に上昇を与える 100% 半数の男性ひな、したがって変異つがいでない雌はその後の分析のため使用することができます変異体の男性の数が多いに上昇を与えることができます。 注: 重要な遺伝子の突然変異が存続 G0注入雌の (推定上突然変異のヘテロ接合体) 野生型雄; の交配によって保たれる必要があります。G1女性子孫の半分は、致死性のキャリアがこの特定のケースで G1の男性の子孫の半分は致死突然変異の遺伝のため死ぬべきです。</li>
	<li>Outcross G0大人と目標が遺伝子の場合、遺伝子マーカーを用いた遺伝子挿入画面 G1子孫。現在遺伝子であるN. vitripennisままになります。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

(名) vitripennisのゲノムの最近の配列はこの種23未知遺伝子の機能的特徴を分子ツールの重要な必要性のパワーを解き放ちます。CRISPR Cas9 システムと多くの遺伝子編集ツール、生物24の数の遺伝子機能の調査で非常に貴重であると証明しました。ただし、遺伝的突然変異を生成するこれらのツールを実行する必要胚薬剤。したがって、ここでは効率を可能にする革新的な数を含む詳細な視覚技術を実証(名) vitripennis胚薬剤。
全体的に、この詳細な手法が既存法23、に関しての重要な革新的な数を提供していますにできる効率的な(名) vitripennis胚薬剤。たとえば、胚の迅速な収集を容易にする産卵ツール (泡ストッパー) が作成され、大幅内で多数の胚のコレクションを容易にするホスト (図 1) の後端に完全に産卵を制限するために使用時間の短い期間です。より多くの卵を収集するために多数があるハチのコロニーを飼育技術も改善され、定義されています。さらに、胚の配置を加速する胚は効率よく配置して両面粘着テープを使用して (図 3) の場所に胚を保護することがなく注入することができます胚アライメント装置を開発します。
さらに、射出しない胚を乾燥や油とそれらをカバーの中に胚を水で湿った保つことによって生存率を改善したことがわかった。さらに、いくつかの毛細管ガラス種類がテストされる、 N. vitripennisマイクロインジェクション (表 1、図 4) の完璧な針を構成するパラメーターが決定されます。また、次のインジェクション、料金は事前に刺されたホストに挿入された卵を孵化から大幅に長くことができる胚の生存は高湿度 (70%) の部屋に配置されます。これらの技術革新は、 N. vitripennisマイクロインジェクション プロシージャのより効率的に、成功しました。
このプロトコルは、ユーザーの好みに応じて噴射装置と手順を飼育面でのマイナーな変更が可能です。ただし、いくつかの重要な手順が正常に(名) vitripennisの突然変異体を生成するために不可欠になります。たとえば、注入された胚は、迅速に作業 &#62; 1 h 古いと、注射針を確実に胎児への損傷を最小限に抑えるのに十分なシャープ両方不可欠になります。このプロトコルは多くの (ないすべて) の遺伝子の突然変異を生成するために効果的なする必要があります、1 つの主要な制限はターゲット シーケンスを決定する PAM (NGG) シーケンスを対象とする CRIPSR/Cas9 要件。
この改善法を使用してゲノムの変更、削除、突然変異などの多くの種類を生成し挿入遺伝子を生成する CRIPSR/Cas9 技術21、またはも遺伝子の挿入を使用してが多分結論としては、(名) vitripennis、大きくこの生物機能研究を加速させる必要があります。

宝石ワスプ(名) vitripennisは、ハエのようなツノアカニクバエ bullata1を食べる肉の二属性 Nasonia内 4 種のひとつです。その高速世代期間、研究室とユニークで重要な生物学的属性の範囲で飼育の容易さのためN. vitripennisは伝統的なモデル生物で見つかった複数の実験ツールの開発に焦点をされています。.たとえば、いくつかのユニークな生物学的属性含めるハプロ二倍体再生システム2、微生物と遺伝的寄生虫3,4との関係および supernumary (B) 染色体5,6 ,7。一緒に取られて、これらが作るN. vitripennis毒生産8,を含む他の人に加えて、これらのプロセスの分子および細胞の側面の解明に向けた実験のための重要な実験システム9、セックス定量10、11進化、および軸パターン形成12,13,14の開発。また、 Nの生物学を調査する遺伝のツールキット。vitripennisが最後の 10 年間で大幅に増加または、高解像度ゲノム15ゲノ ム配列、いくつかの遺伝子発現研究16,17,18, と機能的に依存する RNA 干渉 (RNAi)19、20少ないとこの生物で逆遺伝学を実行する機能を一緒に改善している遺伝子発現を混乱させる能力。
にもかかわらず、多くの重要な科学的な進歩およびこの有機体の拡張ツールキットの現在の知識の時点のみ 1 つのグループによって正常に遺伝的ゲノムの変更21を生成する萌芽期の薬剤。これは主に彼らはかなり壊れやすいと小さく、~2/3 を操作することが一般的に困難それらショウジョウバエ胚のサイズであること、 N. vitripennisの胚での作業の難しさ。さらに、 N. vitripennis女性では入金済み刺されたハエの蛹、胚発生、幼虫と蛹の発育の全体が発生しますが自分の卵。したがって、成功した薬剤、前胚ステージで効率的にホスト蛹、すぐに microinjected し、ホストする開発に戻ってすぐに移植から胚必要があります収集します。これらの手順には、精度と microinjected 胚や蛹のホストでは、非常に困難なテクニックを作ることの損傷を避けるために器用さが必要。にもかかわらず、 N. vitripennis胚マイクロインジェクション22を説明する 10 年以上前に公開されて短いプロトコルの 1 つがあります。ただし、この手順では、新たに置かれた胚が乾燥する必要があります、マイクロインジェクション、卵を固定する粘着テープを使用し、技術の視覚的なデモは含まれません。したがって、視覚プロシージャ、遺伝のゲノムを生成する任意の基本的なラボ環境で続くことができるN. vitripennis胚薬剤の改良された手順プロトコルの詳細を含め更新および改訂版のプロトコルは、ここで説明しました。この重要なモデル昆虫に変更。

<table><tbody><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>41515</td>昆虫<td>飼育ケージ</td></tr><tr><td>ガラス試験管フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>982010</td><td></td></tr><tr><td>肉フライ蛹、Sarcophaga bullata</td><td>Carolina昆虫</td><td>144440</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ電極ベベラー</td><td>サッター機器</td><td>BV10</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンド研磨プレート(0.7u〜2.0u先端サイズ)</td><td>サッター機器</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>ワールド精密機器</td><td>カイトR</td><td></td></tr><tr><td>フェムトジェットエクスプレス プログラマブルマイクロインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000またはP-2000</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>複合顕微鏡</td><td>ライカ DM-750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミノケイ酸ガラス毛細管 1mm(外径)×0.58mm(内径)</td><td>サッター機器</td><td>BF100-58-10</td><td>ホウケイ酸または石英</td></tr><tr><td>アイデンティプラグ</td><td>JAECE</td><td>L800-B</td><td>フォームプラグ</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>マイクロカバーガラス</td><td>VWR</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>接着剤</td><td>アロン アルファ</td><td>AA471</td><td>顕微鏡スライドにカバースリップを接着するため</td></tr><tr><td>ファインチップペイントブラシ</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>超極細先端鉗子</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>フェムトチップ マイクロローダーチップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td>・サイエンティフィ<td>ック E5242956003</td><td></td></tr></tbody></table>

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

宝石ハチキョウソヤドリコバチホスト共生相互作用、他の中で、毒の合成、ハプロ二倍体性決定性決定を含むプロセスの研究のための効果的なモデル システムとして浮上しています。この生物での作業の主要な制限指示されたゲノムの変更を実行するため効果的なプロトコルの不足しています。ゲノム育種の重要な部分は、マイクロインジェクションを通じて胚に CRISPR/Cas9 分子を含む試薬を編集の配信です。この手法は、その小さな胚のサイズ、そして萌芽期の開発が完全に行われるという事実のために主に(名) vitripennisで実行する特に困難なマイクロインジェクションが多くのモデル生物で確立している間、寄生のハエの蛹。次の手順は、ホスト蛹、microinjecting、それらを寄生からハチ胚を効果的に除去するための合理化された、視覚的手順を示すホストに戻って慎重にそれらを移植し、これらの重要な課題を克服します。継続との開発完了。このプロトコルは強くこの生物先端ゲノムの変更を実行する研究グループの機能を強化します。

このプロトコルは、コロニーの飼育、前の胚の胚のコレクション、アライメント、マイクロインジェクション、注射後以降の移植に詳細なガイドラインを提供し、効率的なゲノム工学; vitripennisに使用できます。Vitripennisに成功したマイクロインジェクションの手順の一般的な流れは、図 2に示すとおり、: (i) チームメイトに雄と雌の成体を許可する (~ 4 日)、(ii) 新鮮なホスト ハエ蛹 (S. bullata) の供給は、雌成虫の交尾と産卵のため、変更された泡プラグ (~ 45 分)、(iii) 公開前胚胚ワスプを収集し寄生寄主蛹キューティクルを慎重に剥離 (~ 15 分)、胚を収集 (iv) の整列 (~ 15 分)、(v)胚へのマイクロインジェクションのゲノム改質材 (~ 15 分)、(vi) 慎重に配置する挿入された胚の適切な開発を許可する前に刺されたホストに (~ 15 分)、(vii) は、転送することによって注入された胚/ホストの脱水を防止して約 70% の相対湿度で加湿チャンバーに (~ 15 分)。寄生ホストに、 N. vitripennis胚の完全な開発を許可する約 14 日間孵化します。一度注入すると、大人 (viii) ホストから出てくる分離 mate 商品、予想される突然変異の有無を個別にそれらの画面します。
効果的な針貫通、 N. vitripennis胚へのマイクロインジェクション毛細管ガラス針水晶、アルミノケイ酸塩、およびホウケイ酸型を含むフィラメントのいくつかの種類をテストします。針の質は、注入中に破損/詰まりの回避と両方胚の生存と変換効率の高い率を達成するために重要なことがわかった。ガラスの種類ごとに効果的なプロトコルは必要な注射のようなの長い先端; vitripennis胚マイクロインジェクション (P-1000、および P-2000) の異なるマイクロ ピペット引き手を使用しての効果的なを持っているために針をプルに開発された (表 1、 図 4)。
手順を最適化するために、ゲノム改質材の様々 な量の注入生存率を測定します。ここで使用されるゲノム改質材が混合ガイド Rna や CRISPR を介したゲノム編集のための Cas9 蛋白質名 vitripennis21でうまく動作する以前に示されました。ここで何があったと同様に報告シナバー遺伝子の設計・合成、sgRNA ターゲットします。ターゲットしてこの遺伝子を中断することで、簡単に個人を特定できる表現型変化は生物19、21の目の色に見られます。様々 な sgRNA の濃度を組み合わせて注入混合物 (0、20、40、80、160、および 320 ng/μ L) Cas9 蛋白質 (0、20、40、80、160、および 320 ng/μ L) が作成され、野生型名 vitripennisの胚に注入します。注入された胚の生存率は用量に依存した (表 2)21をことが判明します。添加オフターゲット効果に起因するかもしれない減少生存率 (表 2) に sgRNA と Cas9 タンパク質の濃度の増加。湿度が高い (~ 70%) 低湿度としてホストに移植後の胚の生存にとって重要であることが分かった (~ 10%) すべて注入された胚を 100% 死につながった。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig1.jpg"> 
図 1.ホスト蛹の準備(S. bullata) の N. vitripennis 胚産卵します。(A)若い、古いs. bullataの蛹。古い蛹ある暗いキューティクル若い蛹は、キューティクルをより赤味がかった色合いを持っています。若い蛹が産卵を最大化するために好ましいです。蛹の後方と前方の端は、「クレーターのような開設後端に前方の一端が丸い点に対しでも区別できます(B) N. vitripennis胚産卵.のホスト (S. bullata) 蛹の準備ホストの蛹を挿入、蛹を持って泡プラグ サイズの穴を切り開いた。前方エリアに産卵の最大濃度にさらされる前方の 0.2 cm、プラグ内部ホスト蛹顔の後部の側面があります。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig2.jpg"> 
図 2.タイムラインを作成するため ; vitripennis マイクロインジェクションによる変異体。(名) vitripennis胚のコレクション、CRISPR/Cas9 マイクロインジェクションおよびポスト注入のプロシージャのタイムライン。(名) vitripennis大人は 4 日間 (私) の産卵部位の不在でチームメイトを許されました。新鮮な肉フライ ホスト蛹、 s. bullata、だけ後端の 0.5 cm を公開する泡ストッパーの中に配置は寄生 (ii) のように 45 分の妊娠女性に紹介されました。同時にマイクロインジェクション針、CRISPR/Cas9 コンポーネントを含む注入材料は、(iii) を作製しました。胚がホスト (iv) から収集された、(v) を揃え、および CRISPR/Cas9 コンポーネント (vi) を注入します。注入された胚は慎重に事前刺されたホスト (vii) に移され、完全に開発された (14 日) (viii) まで培養しました。大人が現れると、ターゲット遺伝子 (ix) で予想される CRISPR/Cas9 誘発突然変異の表現型の変異体が上映されました。全体の手順では、完了するため 19 日通常かかります。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig3.jpg"> 
図 3.胚を並べるため改造顕微鏡スライドです。(A) A coverslip。(B) A 顕微鏡スライド。(C) 胚アライメント装置。観察は、ライン胚に注入に使用する顕微鏡スライド上に接着できます。Coverslip の目的は、エッジを可能にする簡単な操作と胚の裏地として行動することです。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56990/56990fig4.jpg"> 
図 4.注射針の準備。善と悪のアルミノケイ酸ガラス針の (A) の例です。(B) 角度、正しく面取りおよび不十分なベベル針のヒント。アルミノケイ酸ガラス毛細管ピペットの引き手を使用して引っ張られました。作り出された針の先端が軽く開くし、面取り機を使用して洗練されました。良い傾斜針は非常に鋭い先端で悪い傾斜針、鈍い先端。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56990/56990fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>毛細管ガラス タイプ</td>
			<td>サッター針の引き手モデル</td>
			<td>熱</td>
			<td>フィラメント</td>
			<td>速度</td>
			<td>遅延</td>
			<td>プル</td>
			<td>圧力</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>石英</td>
			<td>P-2000</td>
			<td>750</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
			<td>150</td>
			<td>165</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>アルミノケイ酸塩</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>605</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ホウケイ酸塩</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>450</td>
			<td>-</td>
			<td>130</td>
			<td>80</td>
			<td>70</td>
			<td>500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1。針の引き手の設定。 メモ: 各研究室が独自の針の引き手の設定を最適化する必要がありますので、針の引き手設定異なるマシンです。このテーブルは、李らから変更されています。21
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="3">sgRNA 1</td>
			<td rowspan="3">Cas9</td>
			<td rowspan="3">合計胚</td>
			<td>移植 (湿度 10%)</td>
			<td colspan="4">移植 (湿度 70%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>幼虫の生存者</td>
			<td>幼虫の生存者</td>
			<td colspan="3">大人の生存者</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>合計 (%)</td>
			<td>合計 (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>合計 (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ない注射</td>
			<td>ない注射</td>
			<td>100</td>
			<td>94 (94)</td>
			<td>96 (96)</td>
			<td>66</td>
			<td>26</td>
			<td>92 (92)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水</td>
			<td>水</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>78 (78)</td>
			<td>44</td>
			<td>32</td>
			<td>76 (76)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ng/μ l</td>
			<td>20 ng/μ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>74 (74)</td>
			<td>34</td>
			<td>34</td>
			<td>68 (68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ng/μ l</td>
			<td>40 ng/μ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>67 (67)</td>
			<td>30</td>
			<td>32</td>
			<td>62 (62)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ng/μ l</td>
			<td>80 ng/μ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>53 (53)</td>
			<td>24</td>
			<td>22</td>
			<td>46 (46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>160 ng/μ l</td>
			<td>160 ng/μ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>41 (41)</td>
			<td>16</td>
			<td>22</td>
			<td>38 (38)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>320 ng/μ l</td>
			<td>320 ng/μ l</td>
			<td>100</td>
			<td>0 (0)</td>
			<td>25 (25)</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>20 (20)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2。注入と移植生存と変異率注射 sgRNA と Cas9 の濃度の違いに基づきます。Liらからこのテーブルが変更されています。21

キョウソヤドリコバチ胚のマイクロインジェクションは、ゲノムの遺伝の変更を生成するため不可欠な方法です。マイクロインジェクションと大幅にこの生物の将来ゲノム操作を容易にするキョウソヤドリコバチ胚移植の手順の詳細については、ここで説明しました。

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

この手順の全体的な目標は、ゲノム操作を容易にするために、nasonia vitripennis胚へのマイクロインジェクションを成功裏に行うことです。この方法は、毒の生成や性決定など、nasonia vitripennisの生物学に関連する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術を使用する主な利点は、スズメバチのゲノムを直接操作でき、さまざまな高度なゲノム修飾を提供できることです。その手順を実演するのは、当研究室のポスドクであるMing Liです。まず、200〜500匹の成虫を虫寮のケージに雌と雄の比率が3対1で配置することにより、いくつかのN.vitripennisコロニーを設定します。スズメバチを摂氏25度プラスマイナス1度に維持し、相対湿度30%、明暗サイクル12〜12で維持します。2日間、交配した雌が新鮮なS.bullataの蛹と、1〜10容量の小さな液滴のショ糖水溶液を食べられるようにします。次の2日間、クロバチの蛹を取り除き、メスのハチから産卵部位を奪い、非常に妊娠させます。S.bullotaの蛹の宿主を新鮮に保つために、入手後すぐに摂氏4度で保管し、必要な場合にのみ取り外してください。赤い色の蛹を持つ若い宿主と、暗い色の蛹を持つ古い宿主を区別します。雌のスズメバチが若い宿主に寄生するのを許すために、個々の新鮮なS.bullataの蛹を中央に開けたフォームストッパーに入れます。寄生の濃度を最大化し、胚の収集を容易にするために、丸みを帯びた宿主の前端の約0.2センチメートルのみを露出させます。これは、より厚く、クレーターのような開口部を含む後端と比較してです。この配置で宿主の蛹をケージに入れ、ハチが寄生するまで約45分待ちます。寄生した宿主を手で回収し、残っているハチを軽くたたいたり吹き飛ばしたりして、寄生した宿主を取り除きます。それらを約15分ごとに新鮮な宿主と交換して、注射中に初期段階の卵を収集し続けます。解剖顕微鏡下で、鉗子を使用して、寄生したばかりの宿主の外側の蛹の後端を慎重に剥がし、N.vitripennisの卵を露出させます。次に、液体接着剤を使用して、きれいなスライドガラスにカバースリップを接着することにより、胚アライメントスライドを準備します。濡れた先端の細い絵筆で、宿主の柔らかい蛹の皮膚を傷つけないように、宿主の胚を慎重に払い落とします。次に、濡れた絵筆で、約20個の胚を1つずつ、カバースリップの側面のすぐ隣にあるスライドに移します。胚の前端をカバースライドの端に向け、胚の後端が同じ方向を向くようにします。これにより、すべての胚間で同じ位置に注入する精度が向上します。テキストプロトコルに従って注射針を引っ張った後、針先を摂氏25度のダイヤモンド研磨プレートに約10秒間わずかに触れて、針先を面取りします。ゲノム改変試薬からなる注入混合物を調製し、氷上に置いておきます。マイクロローダーチップを使用して、注射針に2マイクロリットルの注射混合物を装填します。次に、胚が裏打ちされたスライドガラスを複合顕微鏡のステージに置きます。針を胚の後端に垂直に25〜35度慎重に挿入します。次に、1〜5ピコリットルの注射混合物を注入し、注入で胚がわずかに膨らむことを確認します。目詰まりが発生した場合は、針の面取りをし直してみてください。N.vitripennis胚の細胞質は異常に粘性があり粘着性があり、これが頻繁な針詰まりにつながります。一度に約20〜40個の卵を注入し、その後停止します。注入した卵を濡れた絵筆で注入した卵に軽く触れて移し、ホストに入れます。次に、新しく産まれた新鮮な卵のバッチを使用して、注入を続けます。理想的には、このステップは、1人が卵子を集めて並べている間に、別の人がゲノム修飾成分を注入し、注入した胚を宿主の蛹に移植しているときに最も効果的です。マイクロインジェクション後、濡れた絵筆を使用して、以前に刺されたS.bullataの蛹に一度に最大40個のGゼロ胚を1つずつ慎重に配置します。宿主の蛹を湿らせた濾紙と綿球のあるシャーレに入れ、注入された胚が約1〜2日で孵化するまで、摂氏25度、湿度約70%でインキュベートします。重要なことは、宿主は剥がれた蛹のまま残すことができ、N.vitripennisの卵は、乾燥を防ぐために加湿されたチャンバーでインキュベートされている限り、正常に成長します。Gゼロ胚が孵化した後、宿主の蛹を新しいシャーレに移し、摂氏25度、湿度70%で孵化させます。宿主の蛹と注射されたGゼロ幼虫を毎日監視します。宿主の蛹に悪臭がある場合は、注入した幼虫を新しい健康な宿主の蛹に移します。N.vitripennis胚への効果的な針の挿入とマイクロインジェクションのために、石英、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸などのフィラメントを備えたいくつかのタイプのキャピラリーガラス針を使用して、さまざまなマイクロピペットプーラーを試験し、N.vitripennis胚のマイクロインジェクションに効果的な皮下組織のような長い先端を確保しました。ここで使用したゲノム改変成分は、より鮮明なゲノム編集のための混合ガイドRNAとcas9タンパク質でした。この実験では、辰砂遺伝子を標的とするsgRNAをcas9タンパク質とともにさまざまな量でN.vitripennisに注入しました。この表は、sgRNAとcas9タンパク質の濃度が増加すると生存率が低下するため、生存率が用量依存的であったことを示しています。この手順を試みるときは、湿らせた細い先端の絵筆または胚ピックを慎重に使用して、操作または移植中にスズメバチの胚に穴を開けたり乾燥させたりしないように注意することが重要です。このビデオを見た後、高度なゲノム改変を成功させるために、スズメバチの胚を効率的に回収、マイクロインジェクション、移植する方法を十分に理解しているはずです。

embryo-microinjection-transplantation-technique-for-nasonia

Research

JoVE Journal

Genetics

RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して...

RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em

このようなジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENS）などのデザイナーヌクレアーゼは非相同エンド入社（NHEJ）と相同組換え（HR）経路の両方をトリガすることによって、マウスの着床前胚のゲノムを変更するために使用することができます。これらの進歩は、正確な遺伝子改変マウスの迅速な生成を可能にする。...

デザイナーヌクレアーゼを用いてマウスゲノムエンジニアリング

このプロトコルの目的は、ロスオブを説明し、利得の栄養外胚葉と着床前マウス胚における内部細胞塊分化につながる段階特異的受容体としてネオゲニン識別に適用可能である関数法です。...

loss-が及び着床前マウス胚の初期の細胞運命決定要因を調査するための機能獲得型のアプローチ

私たちは、 カタユウレイボヤにマイクロインジェクションやエレクトロポレーション技術を使用して、脊椎動物への脊索動物の姉妹グループを、一過性遺伝子導入および遺伝子ノックダウンを提示します。このような方法は、脊索とヘッド感覚上皮、およびヒト疾患関連遺伝子の多くのオルソログを含む脊椎動物の基本的な特性を備えています。この単純な無脊椎動物における機能ゲノミクスを容易にします。...

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

地中海のショウジョウバエ(メドフライ)Ceratitis...

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

このプロトコルは、CRISPR/Cas9遺伝子編集ツールで動作するように最適化された Culex quinquefasciatus...

キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

ここでは、 ナソニアビトリペンシス での効率的なプパルおよび成人注射を胚微小注射の代替手段として説明し、RNA干渉(RNAi)またはCRISPR/Cas9ゲノム編集によるRNAサイレンシングまたは遺伝子ノックアウトのいずれかを使用して目的の遺伝子の機能解析を可能にする。...

ナソニアビトリペニスにおけるRNAiおよびCRISPR遺伝子編集のためのプパルおよび成人注射

昆虫の真社会性の多くの特徴は、コロニー内のコミュニケーションと分業に依存しています。マイクロインジェクションとCRISPRを介した突然変異誘発によるアリ胚の主要な調節遺伝子の遺伝子操作は、真社会性昆虫の利他的行動の性質に関する洞察を提供します。...

アリハルペグナトス塩析装置におけるCRISPRを介した突然変異誘発のための胚注射

我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo...

Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

ここには、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集を介してゲノムを改変する目的で、または生殖系列形質転換を介して顕著な転移性要素を追加する目的で、前細胞トウモロコシウンカ胚を収集してマイクロ注入するためのプロトコルがあります。...

トウモロコシウンカ、 ペレグリヌスマイディス、CRISPR/Cas9ゲノム編集のための胚のマイクロインジェクション

この記事では、ショウジョウバエのphiC31インテグラーゼ媒介トランスジェネシスを例に、トランスジェニックフライを作成するための重要なステップである胚マイクロインジェクションの最適化されたプロトコルを紹介します。...

ショウジョウバエにおけるトランスジェネシスのための胚マイクロインジェクション

学ぶNasonia vitripennis胚のマイクロインジェクション手法。ゲノム操作と遺伝子改変を可能にし、毒液産生や性決定の研究に応用できます。

胚のインジェクションと移植キョウソヤドリコバチゲノム操作手法

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