Name: iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶCRISPR/Cas9を用いたiPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現回復法。Tet-on MyoD系による分化誘導と遺伝子編集技術を組み合わせ、Duchenne型筋ジストロフィー治療への応用可能性を示す。

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著者は何も開示していない。

デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィンの欠如を特徴とする破壊的で最終的に致命的な遺伝性疾患であり、進行性筋萎縮症1、2を引き起こす。我々の結果は、CRISPR/Cas9媒介exon23欠失のアプローチにより、Dmdmdx iPSC由来筋原性前駆細胞におけるジストロフィン遺伝子発現の回復を実証した。この方法には 3 つの利点があります。
まず、非統合RNAベクターを用いてDmdmdxマウス由来真皮線維芽細胞からiPSCを生成した。レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどのiPSCを生成する様々な方法が開発され、宿主染色体に統合してリプログラミング遺伝子を発現させ、安全性に関する懸念を抱きます。プラスミドベクター、アデノ関連ウイルス、アデノウイルスなどのDNAベースのベクターは、非統合的な方法で存在します。しかし、それらは依然として低周波で宿主染色体に統合される可能性がある。本研究では、非統合RNA...

デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、最も一般的な筋ジストロフィーの一つであり、ジストロフィンの不在によって特徴付けられており、世界中の約5,000人の新生児の1人に影響を与える。ジストロフィン遺伝子機能の喪失は、進行性筋線維変性1、2につながる構造的な筋肉欠損をもたらす。組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)媒介遺伝子治療システムは、ジストロフィン発現を回復させ、マイクロジストロフィン(μ-Dys)を用いて遺伝子置換などの筋肉機能を改善するために試験された。しかしながら、rAAVアプローチは、機能性タンパク質3、4の発現を維持するために繰り返し注射を必要とする。したがって、DMD患者においてジストロフィン遺伝子発現を効果的かつ永続的に回復できる戦略が必要である。DMDのマウスモデルであるDmdmdxマウスは、早期終了コドンを導入するジストロフィン遺伝子のエキソン23に点変異を有し、C末端ジストログリカン結合ドメインを欠く非機能的切り捨てタンパク質をもたらす。最近の研究は、小・大型動物5、6、7における正確な遺伝子矯正または変異性エキソン欠失によるジストロフィン遺伝子発現を回復させるCRISPR/Cas9技術の使用を実証した。Long et al.8は、相同性修復(HDR)ベースのCRISPR/Cas9ゲノム編集によりDmdmdxマウス生殖細胞系におけるジストロフィン遺伝子変異を修正する方法を報告した。El Refaey et al.9は、rAAVがジストロフィーマウスで変異型エキソン23を効率的に排除できると報告した。これらの研究では、gRNAは、非相同末端接合(NHEJ)を介してDNA修復後にジストロフィン発現を部分的に回復させた二本鎖DNA切断を引き起こすために、イントロン20および23で設計された。さらにエキサイティングな、Amoasii et al.10は最近、イヌモデルにおけるジストロフィン発現の復元におけるrAAV媒介性CRISPR遺伝子編集の有効性と実現可能性を報告した。
DMDはまた、幹細胞障害11を引き起こす。筋肉の損傷のために, 住宅の筋肉幹細胞は、筋肉分化後に死にかけている筋肉細胞を補充します。.しかしながら、損傷および修復の連続したサイクルは、筋幹細胞12におけるテロメアの短縮、および幹細胞プール13、14の早期枯渇につながる。したがって、自家幹細胞療法とジストロフィン発現を回復させるゲノム編集の組み合わせは、DMDを治療するための実用的なアプローチでありうたることができる。CRISPR/Cas9技術は、機能的な筋肉再生のための自己的に修正された多能性幹細胞(iPSC)を生成し、免疫拒絶反応を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐ可能性を提供します。しかし、iPSCは腫瘍形成のリスクがあり、筋原性前駆細胞へのiPSCの分化によって緩和される可能性がある。
このプロトコルでは、非統合センダイウイルスを用いてDmdmdxマウスの真皮線維芽細胞をiPSCに再プログラミングし、CRISPR/Cas9ゲノム欠失によりジストロフィン発現を回復することを説明する。ジェノタイピングによるiPSCにおけるExon23欠失の検証後、筋染発性筋原分化によりゲノム補正iPSCを筋原性前駆体(MPC)に分化した。

<table><tbody><tr><td>手術器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>31ゲージ針</td><td>各種&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シャープな切開</td><td>各種&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌メス</td><td>各種&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>各種&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞培地(100 mLの完全培地用)</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>ボリューム</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (55 mM)</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.1 mL</td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌薬 Slution 100x</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルス培地 - 高グルコース</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>87 mL</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清特性評価</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>TVP 溶液 (500 mL の完全溶液用)</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td></td></tr><tr><td>ボリューム チキン血清</td><td>Gibco</td><td>16110-082</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>186 mg</td></tr><tr><td>ホスファット緩衝生理食塩水</td><td></td><td></td><td>to 500 mL</td></tr><tr><td>トリプシン (2.5%)</td> <td>サーモ</td><td>15090046</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>mES 増殖培地(全液 500 mL)</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>容量</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール (55 mM)</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌薬 Slution 100x</td><td>コーニング</td><td>MT30004CI</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグルス ミディアム - 高グルコース</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>408.5 mL</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清特性評価</td>された<td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>マウス組換え白血病阻害因子 (LIF)、0.5 x 106 U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>500 &mu;L</td></tr><tr><td>MEK/GS3阻害剤サプリメント</td><td>EMDミリポアコーポレーション</td><td>CS210510-500UL</td><td>500 &mu;L</td></tr><tr><td>MEM非必須アミノ酸溶液(100x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ES細胞培地は4週間以上保存せず、阻害剤と一緒に2週間以内で保存しないでください。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>mES冷凍培地(全液50mL用)</ストロング></td><td><ストロング>会社名</ストロング></td><td><ストロング>>カタログ番号</スト</td>ロング<td><>ストロング</ストロング></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルス中高血糖</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>24.9 mL</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum Characterized</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>マウス組換え白血病抑制因子 (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>50 &mu;L</td></tr><tr><td>材料名/機器</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>RRID</td></tr><tr><td>0.05% トリプシン/0.53 mM EDTA</td><td>CORNING</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Thermo scientific</td><td>J19943-k2</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ溶液</td><td>SIGMA</td><td>A6964</td><td>細胞剥離溶液</td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3552L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-標識ヤギ-抗マウス抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td>AB_2633275</td></tr><tr><td>Alexa488-標識ヤギ-抗ウサギ抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td>AB_2633280</td></tr><tr><td>Alexa555-標識ヤギ-抗ウサギ抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>AB_2633281 抗AFP</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>RB-365-A1</td><td></td></tr><tr><td>AB_59574 anti-&alpha;-Smoothマッスルアクチン(D4K9N)XP</td><td>CST</td><td>19245S</td><td>AB_2734735</td></tr><tr><td>抗ジストロフィン</td><td>サーモ</td><td>PA5-32388 AB_2549858</td><td></td></tr><tr><td>抗LIN28A(D1A1A)XP&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>CST</td><td>8641S</td><td></td></tr><tr><td>AB_10997528 anti-MYH2</td><td>DSHB</td><td>mAb2F7</td><td>AB_1157865</td></tr><tr><td>anti-Nanog-XP</td><td>CST</td><td>8822S</td><td>AB_11217637</td></tr><tr><td>anti-Oct-4A (D6C8T)</td><td>CST</td><td>83932S</td><td>AB_2721046</td></tr><tr><td>anti-Sox2</td><td>abcam</td><td>ab97959</td><td>AB_2341193</td></tr><tr><td>anti-SSEA1(MC480)&nbsp;</td><td>CST</td><td>4744s</td><td>AB_1264258</td></tr><tr><td>対TH (H-196)</td><td>サンタクルス&nbsp;</td><td>sc-14007</td><td>AB_671397</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼライブステイン (500x)</td><td>Thermo</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>ブラストシジン</td><td>S Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI/ESP3I</td><td>NEB</td><td>R0580L/R0734L</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>ミリポア</td><td>205805-250MG</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV&nbsp;</td><td>ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>コンピテントセル</td><td>TakaRa 636763</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 仙台リプログラミングキット</td><td>Thermo</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR Lysis 試薬 (細胞)</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>302-C</td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ (1 U/mL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン塩酸塩</td><td>Fisher Bio試薬</td><td>BP26535</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>ウシフィブロネクチン血漿</td><td>SIGMA</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; QIAEX II ゲル抽出キット (500)</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン ブタ皮から、A</td><td>型 SIGMA</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>HardSet 退色防止封入剤 DAPI</td><td>ベクター</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B (50 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCL Injection</td><td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td><td>45822</td><td></td></tr><tr><td>Kpni-HF</td><td>NEB</td><td>R3142L</td><td></td></tr><tr><td>lenti-CRISPRv2-blast</td><td>Addgene</td><td>83480</td><td></td></tr><tr><td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td><td>Addgene</td><td>99377</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000 トランスフェクションキット</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&nbsp;&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>60625</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP16 マウス MyoD-T2A-dsRedExpress2</td><td>Addgene</td><td>60626</td><td></td></tr><tr><td>マウス オン マウス (M.O.M.)基本キット</td><td>ベクター</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元型血清培</td>地 <td>サーモフィッシャー</td><td></td> 31985070 <td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール 4,000</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAA161510B</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>SIGMA</td><td>TR1003</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td><td>CORNING</td><td>CB354688</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max Premix</td><td>TakaRa</td><td>R045</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>507-PKP</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin 二塩酸塩</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19453980</td><td></td></tr><tr><td>qPCR レンチウイルス滴定キット</td><td>abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>クイックライゲーションキット</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップキット (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN プラスミドプラス ミディキット (100)</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT 逆転写キット</td><td>Thermo scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>分子研究センター、INC</td><td>RN 190</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ反応バッファー</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Terrific Broth Modified</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9729-600</td><td></td></tr><tr><td>ViralBoost試薬 (500x)</td><td>ALSTEM</td><td>VB100</td><td></td></tr></tbody></table>

ipsc由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するcrispr/cas9技術

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされる重度の進行性筋疾患であり、最終的には筋前駆細胞の枯渇につながる。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリドロミックリピート/CRISPR関連9(CRISPR/Cas9)遺伝子編集は、ジストロフィン遺伝子の発現を回復させる可能性を有する。自家誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋肉前駆細胞(MPC)は、幹/前駆細胞プールを補充し、損傷を修復し、免疫応答を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐことができます。本研究では、CRISPR/Cas9と非統合iPSC技術を組み合わせて、回復したジストロフィンタンパク質発現を持つ筋肉前駆体を得ることを紹介する。簡単に言えば、非積分センダイベクターを用いて、Dmdmdxマウスの真皮線維芽細胞からiPSCラインを確立する。次に、CRISPR/Cas9欠失戦略を使用して、再フレームされたジストロフィン遺伝子の非相同末結合を通じてジストロフィン発現を回復させます。94個のピックiPSCコロニーから3つのコロニーにおけるexon23枯渇のPCR検証後、筋分化の調節に重要な役割を果たす重要な転写因子であるMoDのドキシサイクリン(Dox)誘導発現により、iPSCをMPCに分化する。我々の結果は、DMD治療のための将来の治療法を開発する上で大きな可能性を有するiPSC由来MPCにおけるジストロフィン発現を回復させるためにCRISPR/Cas9欠失戦略を用いることを可能にすることを示した。

dmdmdx皮膚線維芽細胞由来iPSCの確立我々は、統合フリーのリプログラミングベクターを用いてDmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からマウスiPSCを生成する効率を実証した。図1Aは、感染後3週間で胚性幹細胞(ESC)様コロニーの出現を実証した。生きたアルカリホスファターゼ(AP)染色によるiPSC誘導の効率を評価する。図1Bは、FACS分析によりAP陽性細胞の割合が約1.8%であったことを示す。SSEA1、Lin28、ナノ、OCT4およびSOX2は、マウス胚性幹細胞に対する多能性マーカー、免疫蛍光染色によるiPSCコロニーに対して陽性であった(図1C)。生体内のiPSCの3つの生殖細胞分化を調べるために、マウスの胃炎にiPSCを筋肉内に注入した。注入されたiPSCは肝細胞(内皮)、平滑筋細胞(中皮)、アドレナリン性ニューロン細胞(エクトーダーム)に分化し、iPS...

ここでは、Dmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からiPSC中のジストロフィン発現を復元し、Tet-on MyoD活性化システムを用いてiPSCを筋原性前駆細胞(MPC)に直接分化させるCas9ベースのexon23欠失プロトコルを提示する。

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

デュシェンヌは筋ジストロフィーで、筋肉前駆細胞の早期排気を引き起こす。これは、最も重度の筋ジストロフィーの一つです。機能的な筋肉再生を促進するために、CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集を用いて、誘導多能性幹細胞由来筋前駆細胞におけるジストロフィン発現を回復させます。CRISPR-Cas9遺伝子編集は、ジストロフィン遺伝子発現を回復する可能性を秘めています。自己iPSC由来の筋前駆細胞は、幹細胞の毛穴を補充し、損傷を修復し、免疫応答を引き起こすことなくDMDのさらなる合併症を防ぐことができます。筋原性前駆細胞へのiPS細胞の異なる薬剤は、iPS細胞における腫瘍再発生のリスクを減少させた。自家誘導多能性幹細胞由来の筋前駆細胞とCRISPR-Cas9媒介性遺伝子矯正を組み合わせたいくつかの治療法は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー治療戦略を有望である。この技術は、心臓、脳、血液疾患を含む自己幹細胞を遺伝的に編集することによって、多くの先天性疾患を治療するために使用することができます。我々は、このアプローチのデモンストレーションは、読者に細胞リプログラミングと遺伝子編集の取り扱い経験を提供できることを示した。逆顕微鏡の下で、感染したマウス胚性幹細胞のコロニーを調べる。皿の底にあるコロニーを自己インクオブジェクトマーカーでマークします。マークされた細胞コロニーを覆うためにグリースクローニングリングを適用します。各クローニングリングに0.05%トリプシン-EDTAの100マイクロリットルを加え、5分間摂氏37度のインキュベーターにプレートを置きます。次に、100マイクロリットルのピペットチップを用いて消化した細胞を、250ミリリットルのMES増殖培地を含む48ウェル培養プレートに移す。5%の二酸化炭素と85%の湿度で37°Cインキュベーターで細胞をインキュベートします。彼らは70%合流を読むとき, よく成長した細胞を持つ井戸を選択し、30分間消化するためにTVP溶液の250ミリリットルを追加します。次に、各ウェルから6センチメートルの皿に細胞培養を移す。クローニングリングとインキュベーションを繰り返し、均一で寮状のクローンが得られるまで繰り返します。次に、1ミリリットルのTVP溶液を加えて、準備したマウスiPSCを消化します。フィブロネクチンとゼラチンでコーティングされた24ウェルプレートに細胞培養液を移し、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。細胞が50%合流した後、ポリブレン当たり8マイクログラムを含む500マイクロリットルの新鮮な培養培地に切り替えます。次に、マウスiPSCにレンチウイルス粒子溶液の100マイクロリットルを加える。5%の二酸化炭素で摂氏37度で3日間細胞をインキュベートする。次に、24時間以内に殺滅率が半分であるブラストシジンおよびハイグロマイシンBの最小濃度を決定する。1ミリリットルブラストシジンあたり2.5マイクログラム、1ミリリットルハイグロマイシンBあたり100マイクログラムの培地を細胞に加え、3日間待ち、感染細胞を刺すように付着したままの細胞を選択します。選択したマウスiPSCを0.5ミリリットルのTVP溶液で消化し、それぞれが新しい24ウェルプレートで、セルを摂氏37度で30分間インキュベートし、5%の二酸化炭素を加えます。次いで、iPSCを単一細胞にピペットし、細胞計数チャンバーを有する細胞を数える。約150個の消化単一細胞を選択し、MES培地で10センチメートル皿に希釈し、5%の二酸化炭素で摂氏37度で培養する。約10日後、逆顕微鏡の下で、10マイクロリットルの無菌ピペットチップを使用して単一のコロニーを選び、各コロニーを96ウェルプレートのTVP溶液の50マイクロリットルに移します。37°Cで30分間消化します。CRISPR/Cas9編集による多能性幹細胞の収穫を成功させるためには、信頼性の高い手動クローニングピッキングが不可欠です。その後、消化した細胞を各ウェルから別の2つの96ウェル培養プレートに移して分割します。70%コンフルエントまで摂氏37度でインキュベート。70%合流の細胞コロニーで、96ウェルプレート内の培地を取り除きます。1%のプロテイン酵素K溶液を含む25マイクロリットルの溶解試薬を各ウェルに加え、溶解液を別の96ウェルPCRプレートに移します。PCRプレートを粘着シールで密封し、サーマルサイクラーでプレートを摂氏55度で30分間インキュベートし、摂氏95度で45分間摂氏95分で細胞を溶性し、プロテネラーゼKを変性させる。、およびDMD Exon23プライマーの1マイクロリットル。原稿に従ってPCR反応を開始します。次いで、2.2マイクロリットルの負荷バッファーを供給したPCR反応を2%アガロースゲルにロードします。ゲルを100~150ボルトで30分間実行し、UV光下でゲルを検査します。このプロトコルでは、変異体Exon23に隣接する2つのガイドRNAが設計されました。Cas9媒介性二本鎖破断および非相同的な終末結合後、変異体Exon23が削除され、切り捨てられたが機能的なジストロフィン産生を可能にした。トリプシン溶液の漏れを避けるために、我々はリングの底に均等にグリースを適用する必要があります。CRISPR/Cas9ゲノム編集とトットオンMyoD活性化システムの組み合わせは、遺伝子回収基底前細胞を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者における自己移植のための安全で実現可能かつ効果的な戦略を提供します。

crisprcas9-technology-restoring-dystrophin-expression-ipsc-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋原性前駆細胞は、筋ジストロフィーを治療するための細胞治療戦略の有望な候補である。このプロトコルは、急性および慢性筋肉再生のマウスモデルにおけるiPSC由来メソアンジオ芽細胞(筋前駆体の一種)の生着および分化を評価するために必要な移植および機能的測定について記述する。...

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

このプロトコルは、筋ジストロフィー患者からの尿由来細胞の分離のための詳細な手順を伴います。それらは、センダイウイルスの形質導入を通じて効率的かつ迅速に再プログラミングされます。...

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。...

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips)...

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR...

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

編集を表す DNA エピゲノム強力な治療アプローチを対象としました。このプロトコルは、生産、精製、ひと誘導多能性幹細胞 (こと) のエピゲノム編集アプリケーションに CRISPR dCas9 DNMT3A 遺伝子をかくまっているオール ・ イン ・ ワン...

レンチウイルスベクター人間にエピゲノム編集ツールの効率的な配信用誘導多能性幹細胞由来の疾患モデル

一過性エクソソーム通常筋前駆細胞由来の移植によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー...

精製と筋前駆細胞移植派生エクソソーム デュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するために

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。...

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

このプロトコルは、ガイドRNAの設計からノックアウトクローンの細胞クローニングおよび特性評価まで、CRISPR/Cas9を使用してノックアウト筋芽細胞を生成する方法を説明しています。...

レンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

学ぶCRISPR/Cas9を用いたiPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現回復法。Tet-on MyoD系による分化誘導と遺伝子編集技術を組み合わせ、Duchenne型筋ジストロフィー治療への応用可能性を示す。

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

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