Name: グリア線維酸性タンパク質およびその疾患関連変異体の生化学的解析における実験的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学ぶGFAPと疾患関連変異体の生化学的解析手法。グロー放電処理、イオン交換クロマトグラフィー、電子顕微鏡観察を用いて、アレクサンダー病のメカニズム解明と治療標的探索への応用を示す。

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<table><tbody><tr><td>30%アクリルアミド/ビス溶液 37.5:1</td><td>バイオラッド</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム(APS)</td><td>バイオラッド</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>USB</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>抗GFAP抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>12389</td><td></td></tr><tr><td>抗ユビキチン抗体</td><td>ミリポール</td><td>ST 1200</td><td>クローンFK2</td></tr><tr><td>アヴァンティ J-26S XP遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロアンフェニコール</td><td>USB</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>CM-セフローズ</td><td>シチバ</td><td>1707 1901</td><td></td></tr><tr><td>クーマッシーブルー染料</td><td>USB</td><td>32826</td><td></td></tr><tr><td>銅グリッド</td><td>テッド・ペラ</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>CS 150 NX マイクロ超遠心機</td><td>日立</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ドゥンスホモジナイザー</td><td>ウィートン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>UR</td><td>DTT</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 BL21(DE3) pLysS株</td><td>アジレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イージーグロウ</td><td>テッド・ペラ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL試薬</td><td>パーキンエルマー</td><td>ネル105001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15699</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>18312</td><td></td></tr><tr><td>HiRes Sコラム</td><td>シチバ</td><td>2927 5877</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q コラム</td><td>シチバ</td><td>1711 5301</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>UR</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ハネウェル</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>LBミディアム(LBアガー)</td><td>USB</td><td>75851</td><td></td></tr><tr><td>LBミディアム(LBブロス)</td><td>BDディフコ</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>メルカプトエタノール</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ハネウェル</td><td>31434S</td><td></td></tr><tr><td>NGCクロマトグラフィーシステム</td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オプティマ XE-90 超遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>アクロス・オーガニクス</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチルネイミン</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>ローター</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S55Sローター</td><td>日立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S80AT3ローター</td><td>日立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>USB</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>SDS-ページ</td><td>バイオラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 520ヤギ抗マウスIgG&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td>12005867</td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 700ヤギ抗ウサギIgG&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td>12004161</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>テメッド</td><td>USB</td><td>76320</td><td></td></tr><tr><td>透過電子顕微鏡H-7700)</td><td>日立</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>トライトン X-100</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ウラニル酢酸塩</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>ハネウェル</td><td>15604H</td><td></td></tr></tbody></table>

グリア線維酸性タンパク質およびその疾患関連変異体の生化学的解析における実験的アプローチ

Experimental Approaches for Biochemical Analysis of Glial Fibrillary Acidic Protein and Its Disease-associated Variants

AxDを引き起こす変異がGFAPの組み立て特性にどのように影響するかを調べるため、PETベースの発現系を用いて細菌内で組換えタンパク質を作り出しました。GFAPの発現および精製プロトコルを詳細に説明し、WT GFAPを例に挙げます。IPTG誘導(図1A、レーン2)後、GFAPは包摂体調製(図1B)とイオン交換クロマトグラフィー(CMカラム、図1C、レーン1)とQカラム(図1C、レーン2・3)を用いた3段階のプロセスで精製されました。
精製組換えGFAPはin vitro透析で組み立てられ、ウラニル酢酸塩によるネガティブ染色の後、電子顕微鏡で可視化されました。WT GFAPは典型的な10nmフィラメントを形成しました(図2A)、一方でR239H GFAPは凝集する傾向がありました(<str...

Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) is a key intermediate filament protein critical for maintaining the structural integrity and function of astrocytes ...

experimental-approaches-for-biochemical-analysis-glial-fibrillary

Research

JoVE Journal

Biochemistry

我々は明らかに人間の皮質ホモジネート、SDS -...

ヒト皮質組織におけるAβ多量体のSDS-PAGE/Immunoblotの検出は、抗原エピトープの検索を使用してホモジネート

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。...

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

原子間力顕微鏡とバイオパニング技術を組み合わせて、低濃度であってもあらゆる生物学的材料に存在する疾患特異的タンパク質変異体に対する抗体を取得するためのネガティブおよびポジティブバイオパニングシステムを作成しました。...

筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

ELISAが新しい定量的アプローチを提供することが説明されています。それは、シヌクレイノパシーのマウスモデル（M83）において、Ser129リン酸化されたα-シヌクレイン（αSD）またはタンパク質のC末端部分に対する抗体を用いて、疾患に関連するα-シヌクレインを特異的に検出します。...

人間A53T変異αシヌクレインを過剰発現するトランスジェニックマウスの脳における強化ELISAによる疾患関連αシヌクレインの検出

ここでは、死後のヒト脳組織からますます不溶性/凝集したα-シヌクレイン（α-syn）を単離するためのプロトコルを提示します。界面活性剤強度が増大するバッファーと高速超遠心分離技術の利用により、疾患組織および非疾患組織におけるα-syn凝集の変動特性を調べることができます。...

パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

フィブリン凝固組織に及ぼす β-アミロイドを分析する個別にまたは組み合わせて使用することができます 2...

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析

ここでは、パーキンソン病に関与するαシヌクレインの疾患特異的立体構造変異体および複数のタンパク質の同定を可能にする皮膚生検セクションにおける自由浮遊間接免疫蛍光アッセイのプロトコルを提示する。末梢神経系。...

自由浮遊免疫蛍光アッセイによる皮下末梢神経線維におけるアルファシヌクレイン凝集体の標的化

このプロトコルは、脳の寄付プログラムと脳の適切な特性を通じて個々の脳老化軌道を追跡する方法を記述する。脳のドナーは、連続多次元評価を含む長期的な縦断的研究に関与しています。プロトコルは、脳処理の詳細な説明と正確な診断方法論が含まれています。...

老化脳の収集、処理、特徴付けのためのアッビアテグラッソブレインバンクプロトコル

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

ここでは、hSOD1G93Aラットモデルにおける筋萎縮性側索硬化症の病態生理に関する研究のために、細胞内Ca2+のタイムラプスビデオイメージングのために、ラット皮質からグリア細胞、アストロサイト、およびミクログリアの初代培養を調製する方法に関するプロトコルを紹介します。...

ラットアストロサイトおよびミクログリアの初代培養と筋萎縮性側索硬化症の研究におけるそれらの使用

質量分析ベースのプロテオミクス分析によるこの生化学的精製方法は、アミロイド線維コアの堅牢な特性評価を容易にし、アルツハイマー病を予防するための標的の同定を加速させる可能性がある。...

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

学ぶGFAPと疾患関連変異体の生化学的解析手法。グロー放電処理、イオン交換クロマトグラフィー、電子顕微鏡観察を用いて、アレクサンダー病のメカニズム解明と治療標的探索への応用を示す。

グリア線維酸性タンパク質およびその疾患関連変異体の生化学的解析における実験的アプローチ

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