박테리아 조세포 추출물을 사용한 무세포 단백질 발현

무세포 단백질 발현 시스템은 시험관 내 전사 및 번역에 필수적인 분자 메커니즘을 포함하는 박테리아 조세포 용해물을 사용합니다.

이 용해물에는 전사 인자, 리보솜 및 전달 RNA(tRNA)가 포함됩니다.

DNA 주형, RNA 중합효소, 뉴클레오티드 및 아미노산을 포함하는 혼합물을 용해물에 첨가합니다.

PCR 플레이트로 옮기고 원심분리하여 벽에 달라붙은 액체를 수집합니다. 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오.

무세포 단백질 발현을 지원하기 위해 최적의 온도에서 열 순환기에서 배양합니다.

전사 인자는 RNA 중합효소와 결합하여 주형 DNA에 결합하는 복합체를 형성합니다.

이 복합체는 RNA 합성을 촉매하여 뉴클레오티드를 통합하여 메신저 RNA(mRNA)를 생성합니다.

mRNA는 번역을 시작하는 리보솜을 모집하며, 이 동안 tRNA는 해당 아미노산을 전달하여 폴리펩티드 사슬을 형성합니다.

폴리펩티드는 기능성 단백질로 접혀 다운스트림 적용에 사용할 수 있습니다.

DNA 주형을 사용하여 무세포 단백질 발현을 수행하려면 10X 에너지 용액 마스터 믹스, 4X 아미노산 마스터 믹스 분취량 및 DNA 주형을 실온에서 해동합니다. 그런 다음 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 T7 RNA 중합효소 및 RNAse 억제제 스톡을 꺼내 얼음 위에 올려 놓습니다. DNA 주형, 10X 에너지 용액 마스터 믹스 및 4X 아미노산 마스터 믹스가 해동되면 얼음 위에 놓습니다.

얼음 위의 2밀리리터 튜브에 각 성분을 정확한 순서로 첨가하여 무세포 반응 마스터 믹스를 준비하고, 마스터 믹스에 첨가할 때마다 튜브를 부드럽게 튕깁니다. 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 Vibrio natriegens 조세포 용해물을 꺼내 해동될 때까지 10-20분 동안 얼음 위에 놓습니다. 해동된 조세포 추출물을 무세포 반응 마스터 믹스에 적당량의 첨가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.

열순환기를 사용하여 종점 무세포 단백질 발현을 수행하려면 먼저 96웰 PCR 플레이트 바닥의 웰당 10마이크로리터의 무세포 반응 마스터 믹스를 추가하고, PCR 플레이트로 이송하는 각 사이에 튜브를 부드럽게 넘겨 마스터 믹스를 혼합합니다. 플레이트를 1, 000배 g에서 10초 동안 원심분리하여 웰의 측면에 달라붙었을 수 있는 마스터 믹스를 풀링합니다. 그런 다음 증발을 방지하기 위해 플레이트 접착제로 우물을 밀봉합니다.

접시를 섭씨 26도로 설정된 열순환기에 넣고 섭씨 105도로 가열된 뚜껑을 놓습니다. PCR 플레이트에서 반응을 최소 3시간 동안 배양한 후 발현된 단백질을 정제, 정량화하여 다운스트림 공정에 사용할 수 있습니다.