숙주 상피 세포에서 세포내 브루셀라 아포터스 감염의 고처리량 영상

먼저 선천면역의 핵심 매개체인 인터페론 어댑터 단백질의 발현이 감소하여 브루셀라 감염에 더 취약해진 상피세포부터 시작한다.

배지를 원하는 농도로 녹색 형광 단백질 발현 Brucella abortus(겸성 세포내 병원체)를 포함한 감염 배지로 교체합니다.

박테리아와 숙주 세포 간의 접촉을 촉진하기 위해 원심분리기를 한 후, 박테리아가 내부화할 수 있도록 배양합니다.

세포를 혈청 함유 배지로 세척하고, 항생제로 처리하여 세포외 박테리아를 제거하세요.

더 배양하여 브루셀라 가 세포 내에서 증식할 수 있도록 하세요.

세포를 완충제로 세척하고 파라포름알데히드로 고정시켜 세포 내 구조를 보존하세요.

과도한 고정제를 씻어내세요. 그 후 세제 보충제가 첨가된 완충제를 추가해 세포를 투과시킵니다.

잔여 세제를 씻어내고, DAPI를 넣어 핵을 염색한 뒤 마지막 세척을 수행합니다.

자동 현미경을 사용하여 숙주 상피세포 내 브루셀라 감염의 고처리량 이미지를 획득합니다.

자동 플레이트 와셔를 사용해 형질전환 배지를 감염 배지 50마이크로리터로 교환합니다. 후드 내부에서 판을 원심분리기 케이지로 옮기고, 384웰 판을 400g 4도 섭씨로 20분간 원 심분리합니다.

그 후 파라필름을 사용해 플레이트를 밀봉하고, 37도 섭씨와 5%_CO2 상태로 예열된 알루미늄 플레이트 위에 4시간 동안 배양합니다. 자동 플레이트 세척기와의 배양 후에는 10% FCS가 포함된 DMEM에 100 마이크로그램/밀리리터의 겐타미신 또는 GM을 사용하여 세포를 세척하여 세포외 박테리아를 비활성화합니다. 그 후 파라필름으로 플레이트를 밀봉한 뒤, 인큐베이터 내 예열된 알루미늄 플레이트 위에 다시 40시간 더 놓아 엔드포인트 분석을 진행합니다.

셀을 고정하려면 먼저 PBS를 사용해 웰을 세척하세요. 그 후 PBS를 3.7% PFA 50마이크로리터와 0.2몰 HEPES에 pH 7.4에서 교환하고, 실온에서 20분간 배양합니다.

배양 후에는 고정 매체를 교환하기 위해 PBS 50마이크로리터를 사용하세요. 자동 플레이트 세척기로 샘플을 염색하려면, 먼저 0.1% Triton X-100 50마이크로리터를 PBS에 10분간 사용해 세포를 투과시킵니다.

PBS로 세포를 세 번 세척한 후, 50마이크로리터의 PBS와 DAPI 1밀리리터당 1마이크로그램을 추가하고 실온에서 30분간 배양합니다. 그 후 PBS를 사용해 세포를 세 번 세척한 후 빛으로부터 보호하세요. 판을 자동 현미경으로 옮겨.