친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피: 친수성 비드를 사용하여 친수성 극성 분석물을 분리하는 기술

친수성 상호 작용 액체 크로마토그래피(HILIC)는 극성 정도에 따라 친수성 극성 화합물을 분리하는 기술입니다. 극성 작용기를 운반하는 친수성 비드로 채워진 HILIC 컬럼을 설정하는 것부터 시작합니다.

먼저, 평형 완충액과 이동상(유기 용매와 물의 혼합물)을 사용하여 컬럼을 컨디셔닝합니다. 완충 분자는 pH를 안정화시키고 유기 용매는 컬럼을 포화시킵니다. 물 분자는 고정되어 친수성 비드 위에 수성 층을 만듭니다.

형

광 태그로 라벨링된 글리칸 혼합물(친수성 극성 화합물)을 포함하는 샘플을 로드합니다. 최적의 유속으로 컬럼을 통해 이동상 구배를 사용하여 샘플을 실행합니다.

시료가 소수성 이동상을 따라 이동함에 따라 글리칸은 수성층으로 이동하여 불순물을 남깁니다. 그 후, 글리칸은 비드의 극성 작용기를 향해 이동합니다. 여기서 더 많은 극성 글리칸은 강하게 결합하는 반면 덜 극성 글리칸은 느슨하게 결합합니다.

이동상의 소수성이 감소함에 따라 극성이 낮고 머무름 시간이 짧은 약하게 결합된 글리칸이 먼저 용리됩니다. 반대로, 극성이 높고 머무름 시간이 긴 강결합 글리칸은 용리가 지속됩니다.

마지막으로, 검출기는 크로마토그램의 표준 글리칸 피크에 해당하는 용출된 분획의 형광 신호를 검출합니다.

먼저 소프트웨어를 열어 이동상을 제어합니다. UPLC 기기를 50% 용매 B 및 50% 용매 C로 분당 0.2밀리리터의 유속으로 30분 동안 세척합니다. 그런 다음 25% 용매 A와 75% 용매 B로 분당 0.2밀리리터의 유속으로 20분 동안 세척한 다음 분당 0.4밀리리터의 유속으로 세척합니다.

표지된 N-글리칸을 100% 아세토니트릴과 초순수의 혼합물 25마이크로리터에 2:1(부피/부피) 비율로 용해시킵니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 134 x g으로 원심분리하고 구동 파이프를 사용하여 10마이크로리터의 상청액을 UPLC 기기에 로드합니다.

표지된 N-글리칸을 분당 0.4밀리리터의 유속으로 75% 내지 62% 아세토니트릴의 선형 구배로 25분 동안 분리합니다. 그런 다음 섭씨 60도의 UPLC에서 덱스트란 교정 래더/글리코펩타이드 컬럼으로 분석 실행을 수행합니다.

각각 330나노미터와 420나노미터의 여기 및 방출 파장에서 N-글리칸 형광을 검출합니다.