JoVE 실험 백과사전
Immunology
0 조회수 • 3:03 분 • July 8th, 2025
구형 머리와 줄기로 구성된 당단백질인 인플루엔자 바이러스 혈구응집소(HA)를 표적으로 하는 항체를 연속적으로 희석합니다.
표면 결합 HA를 발현하는 형질감염된 포유류 세포에 희석액을 첨가합니다. 항체는 HA 줄기 영역에 결합하여 면역 복합체를 형성합니다.
전사 인자 NFAT의 제어 하에 Fc 수용체를 발현하고 루시페라아제 리포터를 암호화하는 조작된 T 세포를 도입합니다.
배양하는 동안 HA 결합 항체는 Fc 수용체에 결합하고 HA 헤드는 시알산에 결합하여 T 세포 활성화를 유발하고 세포질 칼슘 농도를 증가시킵니다.
이 활성화는 NFAT의 탈인산화를 초래하는 신호 전달 캐스케이드를 시작하여 핵 전좌를 유발합니다.
NFAT는 게놈의 반응 요소에 결합하여 루시페라아제 발현을 유도합니다.
세포 투과성 생물발광 기질을 추가합니다. 루시페라제는 기질을 산화시켜 신호를 생성합니다.
항체 농도 감소에 따른 발광 감소는 HA 줄기 특이적 항체 매개 T 세포 활성화를 확인합니다.
적혈응소 발현 세포를 표적으로 하는 관심 있는 특정 항체의 능력을 평가하기 위해, 바이러스에 감염된 세포 배양물의 상청액을 25마이크로리터의 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 분석 배지로 대체합니다.
다음으로, 별도의 96웰 플레이트에서, 개략도에 따라 밀리리터당 10마이크로그램에서 시작하여 삼중 및 신선한 ADCC 배지에서 관심 항체의 4배 희석을 수행하고, 배경을 포함하고 항체 대조군을 포함하지 않도록 주의한다.
모든 항체가 희석되면 희석된 항체 25마이크로리터를 실험 세포 플레이트의 적절한 해당 웰로 옮기고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 15분 후, 4번째 변형 이펙터 Jurkat 세포에 7.5 x 10을 첨가하고, 웰당 ADCC 배지 75마이크로리터의 최종 부피에 대해 25마이크로리터의 ADCC 배지에서 웰당 적절한 Fc 수용체를 발현시
킨다.플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 6시간 동안 되돌려 놓고, 인큐베이션의 마지막 시간 동안 섭씨 37도 수조에서 루시페라아제 기질 완충액을 해동합니다. 완충액이 준비되면 75마이크로리터의 루시페라제 기질 완충액을 배경 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 추가하고 발광계에서 플레이트를 판독합니다. 그런 다음 형질감염 또는 감염된 세포 배양에서 항체 의존성 세포 매개 세포독성의 배수 유도를 계산할 수 있습니다.