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Neuroscience
0 조회수 • 3:03 분 • July 8th, 2025
소분자 억제제가 함유된 무혈청 배지에 현탁된 마우스 배아 줄기 세포를 취하십시오.
비부착성 배양 플레이트에 세포를 파종하여 세포가 증식하고 응집하여 3차원 배아체 또는 EB를 형성하도록 합니다.
또한 억제제는 비신경 신호 전달 경로를 차단하고 피질 신경 운명을 향한 배아 줄기 세포 분화를 유도합니다.
EB를 튜브로 옮기고 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
효소 칵테일과 DNase가 포함된 용액에 EB를 재현탁합니다.
효소는 EB를 단일 세포로 해리시키는 반면 DNase는 오염된 DNA를 분해합니다.
효소 활성을 멈추기 위해 억제제가 함유된 무혈청 배지를 첨가한 다음 효소를 함유한 상청액을 원심분리하여 제거합니다.
소분자 억제제가 포함된 배지에 세포를 재현탁하고 접착 인자로 코팅된 배양 플레이트에 옮깁니다.
세포는 코팅된 플레이트 표면에 부착됩니다.
억제제는 세포사멸 세포 사멸을 예방하고 피질 중간 뉴런 전구세포로의 세포 분화를 유도합니다.
비부착 조직 배양 접시의 KSRN2 배지에 밀리리터당 75,000개의 세포를 첨가하여 세포를 배아체로 성장시키고 섭씨 37도에서 배양합니다. DD1에서, 조직 배양 처리된 접시를 폴리-L-라이신으로 최소 1시간 또는 섭씨 37도에서 밤새 코팅하여 세포 착륙을 준비합니다.
DD2에서 폴리-L-라이신을 흡인하고 섭씨 37도에서 밤새 라미닌으로 플레이트를 코팅합니다. DD3에서 EB 해리를 시작하기 전에 라미닌을 흡인하고 플레이트를 조직 배양 후드에서 완전히 건조시킵니다.
그 후, 배지와 함께 EB를 15밀리리터 튜브로 옮기고 15배 g에서 또는 EB가 펠릿화될 때까지 3-4분 동안 원심분리합니다. 배지를 흡인하고 DNase를 함유한 세포 박리 용액 3밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
EB 해리를 돕기 위해 3분마다 튜브를 부드럽게 넘깁니다. EB가 더 이상 보이지 않거나 15분이 경과하면, DNase를 함유하는 KSRN2 6밀리리터를 첨가하고 200배g에서 5분 동안 원심분리한다. 그런 다음, LDN193189, XAV939 및 ROCK 억제제 Y27632를 함유하는 KSRN2에 세포를 센티미터 제곱 센티미터당 4.5 내지 5 x 104 세포로 도금한다.