조작된 렌티바이러스를 사용한 뉴런의 인간 만능 줄기세포 분화

부착된 인간 만능 줄기 세포를 형질감염 시약에서 조작된 렌티바이러스로 처리합니다.

이 바이러스는 항생제 내성에 대한 유전자와 테트라사이클린 반응성 및 조절 요소에 의해 제어되는 신경성 전사 인자를 가지고 있습니다.

양전하를 띤 형질감염 시약은 바이러스 융합과 내용물 방출을 향상시킵니다.

바이러스 RNA는 DNA로 역전사되어 줄기 세포 DNA에 통합되어 활성화제 단백질을 생성하는 조절 요소의 발현을 가능하게 합니다.

활성제 단백질과 복합체를 형성하는 테트라사이클린 유도체가 포함된 기초 배지를 추가합니다.

이 복합체는 테트라사이클린 반응성 요소에 결합하여 유전자 발현을 촉진하고 줄기 세포를 뉴런으로 분화하도록 유도하는 신경성 전사 인자를 생성합니다.

형질감염되지 않은 세포를 제거하기 위해 항생제와 함께 기초 배지를 추가합니다.

세포외 기질 또는 ECM을 분해하고 세포를 방출하는 단백질 분해 효소가 포함된 분리 용액으로 세포를 처리합니다.

효소를 제거하고 성숙 배지로 ECM 코팅 웰에 세포를 다시 도금하여 신경 성숙을 촉진합니다.

분화 유도 2일 전에 세포 박리 용액 1ml를 첨가하여 ES 세포를 분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 2밀리리터의 배지로 우물을 씻고 같은 튜브에 추가합니다. 세포를 300배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 배지에 재현탁하고 웰당 5번째 세포에 1배 10의 안착 밀도로 세포를 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에 플레이트합니다.

다음날, Ngn2를 발현하는 렌티바이러스와 PuroR 및 테트라사이클린 트랜스활성제를 신선한 ES 세포 유지 배지에 폴리브렌과 함께 추가합니다. 0일째에 N2가 보충되고 모르포겐이 없는 DMEM/F12 배지에 밀리리터 독시사이클린당 2마이크로그램을 첨가합니다. 첫째 날에 신선한 DMEM/F12와 N2 및 독시사이클린에 퓨로마이신을 밀리리터당 1마이크로그램의 최종 농도까지 첨가합니다.

형질도입된 세포를 퓨로마이신에서 최소 24시간 동안 선택합니다. 2일째에 세포 분리 용액으로 분화 뉴런을 분리하고 매트릭스 용액으로 코팅된 24웰 플레이트에 다시 도금합니다. 독시사이클린이 없는 NBA/B27 배지에서 유지하십시오. 세포외 기질 기반 용액으로 코팅된 플레이트에서 순수 유도 뉴런을 배양합니다.