Name: 모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 배우세요 제브라피쉬에서 말초신경 손상 후 아교세포 역학을 관찰하는 방법입니다. 레이저 절단과 공초점 현미경을 활용하여 신경 퇴행 및 재생 과정에서 세포 반응을 실시간으로 분석할 수 있습니다.

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저자는 뛰어난 기술 지원을위한 귀중한 토론과 정원 테크놀로지에 대한 Kucenas 연구소에 감사드립니다. 작품은 과학 기술 우수 UVA 기금 (FEST) (SK)에 의해 지원되었다.

1. 절제와 라이브 영상을위한 준비 및 제브라 피쉬 배아의 설치 <ol><li> 계란 물에 0.8 % 낮은 용융 아가로 오스의 주식을 준비한다. 필요한 ° C까지 4에서 13X 100mm 처분 할 수있는 문화 튜브 및 저장소로 나누어지는. </li><li> 찬란 모터 뉴런과 관심의 아교 세포 유형 레이블을 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 포함하는 크로스 성인 zebrafish의. 올바른 준비를위한 ° C 배양기 3 이후 28.5 달걀 물과 장소에 제브라 피쉬 배아를 수집합니다. </li><li> 약 24 시간 포스트 수정 (HPF)에서 계란 물을 제거하고 계란 물에 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU) 0.002 %를 추가합니다. 인큐베이터에 배아를 반환합니다. </li><li> 24 96 HPF 사이에, 배아는 형광 해부 범위에서 원하는 형질 전환 유전자의 존재에 대한 검사를해야한다. 신선한 PTU 계란 물에 선택된 배아를 놓고 인큐베이터로 돌아갑니다. </li><li> 유충 6 일 게시물 수정 (DPF) (또는 원하는 나이)에 도달하면, 인큐베이터에서 제거, 설치에 대한 몇 가지 유충을 선택하고, 작은 접시로 전송할 수 있습니다. </li><li> 접시에서 물을 제거하고 즉시 PTU 달걀 물에 약 0.02 % Tricane로 교체합니다. 유충은 약 5 분 마취에 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 30 초 동안 수돗물 전자 레인지 비커에 0.8 % 낮은 용융 아가로 오스의 나누어지는을 배치하거나,​​ 아가가 녹을 때까지. 문화 관 아가로 오스가 터치 (뜨겁지 않은)에 미지근한 느낌까지 비커를 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 마취 유충을 선택하고 단일 또는 다중 아니라 35mm 유리 바닥 접시에 전송할 수 있습니다. 애벌레로 전송 된 모든 물을 제거 후 즉시 요리의 유리 바닥 부분을 채우기에 충분한 따뜻한 아가로 오스와 유충을 커버하지만, 큰 돔을 만들 수 없습니다. </li><li> 아가로 오스는 견고으로 접시의 바닥에 옆으로 애벌레의 위치를​​ 해부 바늘을 사용하여, 다음의 뒷면에 단지 약간 애벌레를 기울이십시오. 그것은 부상 이후 이미징을위한 필수적입니다마운트 된 유충은 접시의 바닥에 유리를 터치 할. 아가로 오스가 응고되어 유충이 고정 될 때까지이 위치에 유충을 유지하기 위해 해부 바늘을 사용합니다. </li><li> 아가로 오스가 완전히 경화되면, 천천히 완전히 아가로 오스와 유충을 커버하는 접시에 충분히 Tricane 물 (이것은 마취에 사용되는 것과 동일한 Tricane 될 수 있습니다) 피펫. </li></ol> 2. 레이저 교정 및 테스트 <ol><li> 모든 공 촛점 현미경 계측, 흥미 진진한 제브라 피쉬의 도입 유전자에 적합한 다이오드 레이저, 및 질소 펌프 색소 레이저를 켭니다. &quot;빈&quot;빔 스플리터가 제자리에 있는지 확인합니다, 레이저 감쇠기는 완전히 개방하고, 435 nm의 쿠마린 염료 셀 위치에 있습니다. 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> 위치에 63X 1.2NA 물 침수 목표를 이동하고 객관적 위에 물이 목적을 침수 매체의 작은 방울을 적용합니다. 63X 목표는 좋은 레이저 절제 정확도 및 물 수 전mmersion 6-7 DPF의 zebrafish의 애벌레로 작업 할 때 필요한 큰 작업 거리를 허용합니다. </li><li> 레이저의 교정을 위해 사용하는 하나의 미러면 유리 슬라이드를 얻습니다. 현미경 스테이지로, 슬라이드, 거울면을 아래로 놓습니다. </li><li> 브라이트 조명 아래 접안 렌즈를 사용하여, 찾아 거울에 흠집이나 에칭에 초점을 맞 춥니 다. 브라이트 빛은 유리 슬라이드에 아래로 빛나는 수 있지만 미러가 긁히거나 에칭 된 장소에서 목적에 통과하고, 접안 렌즈를 통해 검은보고 거울을 유발하고, 에칭은 반점 같이하거나 빛의 라인. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에 에칭을보고 초점을 맞 춥니 다. 레이저 캘리브레이션 및 전원 설정을 제어 창을 엽니 다. &quot;1&quot;펄스의 수와 &quot;3&quot;%의 전송에 감쇠 플레이트를 설정합니다. 펄스의 수는 레이저 각 관심 영역 (RO 내에 발생하는 횟수를 나타냅니다I)와 % 전송은 레이저 출력을 나타냅니다. 정확한 보정 설정은 63X 1.2NA 침수 목적으로 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> 기본 도구 모음에서 타원 도구를 선택하고 하나의 원형 ROI를 생성하는 컴퓨터 화면의 이미지를 클릭합니다. 이미지 위에 무작위로 간격을 4 원형 로아가 될 때까지이에게 3 번 이상을 수행합니다. </li><li> 일부 시스템은 접안에 빛의 경로가 열려있는 경우 레이저가 발사하는 것을 허용하지 않습니다 안전 기능을 포함 할 수 있습니다. 이 경우 수동으로 시간 접안에 빛의 경로를 닫습니다. </li><li> 레이저를 발사. 이것은 각 원형 ROI 내 4 작은 반점 에칭, 1을 생성합니다. 레이저가 발생하지 않는 경우, 레이저가 켜져 있고 제대로 연결되어 있고, 접안에 빛의 경로가 닫혀 있는지 확인 할 수 확인하십시오. 레이저 발생하지만 에칭을 볼 경우, &quot;빈&quot;빔 스플리터가 제자리에 있는지 확인합니다 확인하십시오. 모든 장소에있는 경우, 에칭 아칸소 때 레이저 파워와 &quot;FRAP을&quot;증가가시 마. 10보다 큰 설정 레이저 전원 에칭 유리 필요한 경우,이 레이저 플라즈마 카트리지를 교체해야합니다 나타낼 수 있습니다. </li><li> 에칭 반점 선택한 ROI를 가운데에 나타나는 경우, 보정 (2.12로 진행) 필요가 없습니다. 반점이 중앙에 있지 않은 경우, 보정 설정을 업데이트해야합니다. </li><li> 보정하려면 업데이트에게 보정 설정을 클릭합니다. 레이저 발사하고 이미지는 하나의 에칭 포인트를 포함한 나타납니다. 지점이 표시되지 않는 경우, 보정을 취소 레이저 출력을 증가하고, 다시 교정을 시작합니다. </li><li> 현장의 중심을 클릭합니다. 레이저가 다시 발생하고, 다른 지점이 표시됩니다. 그 점을 클릭하고 교정이 완료되고 9 반점 그리드 방식으로 표시 될 때까지이 과정을 반복합니다. 보정이 성공적으로 완료되었는지 확인하는 단계 2.6-2.9를 반복합니다. </li><li> 현미경 스테이지에서 유리 슬라이드를 제거하고 목표를 청소합니다. OCU에 빛의 경로를 엽니 다라스, 및 &quot;100 % ILL&quot;빔 스플리터 &quot;빈&quot;빔 스플리터를 교체합니다. </li></ol> 3. 레이저 어블 레이션 및 아교 세포 행동의 경과 공 촛점 이미징을 사용하여 신경 절개 <ol><li> 유리 슬라이드를 보유하고 35mm 유리 바닥 요리를 유지하기위한 적절한 단계로 교체하는 데 사용되는 단계를 제거합니다. 63X 1.2NA 물 침지 목표를 계속 사용합니다. </li><li> 목적에 침수 매체의 작은 방울을 적용하고 무대에 탑재 된 유충과 접시를 놓습니다. 클립 접시를 안정. </li><li> 접안 렌즈와 위드 조명을 사용하여 유충을 집중하고 운동 신경을 찾습니다. hemisegments 10-20에 신경을 검사하고 절개를위한 모터 신경을 선택합니다. </li><li> 이미징 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에 신경의 라이브 뷰를 엽니 다. Z-평면을 선택하고 축삭 손상되지 않은 신경 glial 세포의 이미지를 획득. </li><li> 캡처 이미지 소프트웨어에서 시간 경과 영상 설정을 준비합니다실험에 따라 5-30 분 간격의 모든 세포 유형의 Z-전망. 그것은 절제를 수행하기 전에 시간 경과에 필요한 모든 설정을 만드는 것이 좋습니다, 그래서 부상이 완료되면 시간이 경과 시작의 지연이 없습니다. </li><li> &quot;100 % ILL&quot;빔 스플리터를 제거하고 &quot;빈&quot;로 바꿉니다. 접안하는 광경을 닫습니다. </li><li> 신경의 라이브 뷰로 돌아갑니다. 그었 될 축삭을 보려면 적절한 형광 채널을 사용합니다. </li><li> 타원 도구를 사용하여 소작 할 영역의 얇은 타원형 ROI를 만든 다음 선택한 지역 내 작은 ROI를 만듭니다. </li><li> 레이저 설정을 제어 창에서 &quot;2&quot;로 펄스 수를 설정하고 감쇠 판 &quot;18&quot;% 전송합니다. 선택한 로아에서 레이저를 발사. ROI를 내 형광 유물은 레이저 출력을 증가 시키면 약 10 초 정도 기다린 다음 다시 레이저를 발사. 당신이 fluorescen을 일으키는 설정에 도달 할 때까지이 작업을 수행세륨은 ROI를 내 사라질 수 있습니다. </li><li> 10 초 이상 기다린 후 형광 다시 소작 영역을 확인합니다. 실제로 photobleached 때 ROI가 처음 소작 나타날 수 조심. 형광 반환하면 레이저 출력을 증가시키고 다시 레이저를 발사. 개화는 ROI를 내 사라지고 10 초 내에 반환되지 않을 때까지이 과정을 반복합니다. 그것은 낮은 레이저 출력을 시작하고 필요한 전력을 증가하는 것이 가장 좋습니다. 필요한 레이저 파워는 개별 현미경 시스템, 쿠마린 염료의 나이, 시편 장착, 유충의 연령, 조직의 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 이상적인 레이저 전원이 설정되면,이 전원 설정은 동일한 실험에서 다음 신경에 다시 사용할 수 있습니다. </li><li> 제거가 완료되면, 시간 경과 영상을 시작합니다. </li><li> 시간 경과가 완료되면 데이터를 컴파일하고 Z-투상 각 시점의 컬러 복합 만들 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 동작을 분석하는 QuickTime 동영상을 만들동시에 축삭과 glial 세포의. </li></ol>

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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 실험 설계의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 생체 내 이미징 및 2 부상 이후 제대로 설치 유충) 깨끗한 신경 절개를 만들기 위해 레이저를 교정하고 올바른 전원 설정을 선택하는 최소한의 추가 조직 손상의 결과 . 생체 내 이미징 및 이후의 분석을위한 성공 axotomy을 보장하기 위해, 각각의 유리 바닥 요리 중 하나 또는 칸막이 유리 바닥 접시에 여러 유충을 마운트합니다. 레이저 교정 후에, 우리는 신경 절개에 대한 최적의 매개 변수를 식별하기 위해 테스트 유충에 다른 전원 설정을 테스트하는 것이 좋습니다. 레이저는 레이저가) 유지 보수 또는 5 필요) 정확히 4 보정되지 않음) 3, 다른 나이의 1) 유충)가 제대로 2 마운트되지 않은 유충이 사용됩니다 : 이러한 설정은 일반적으로 실험 사이에 상당히 일관성이 있지만, 경우 변경할 수 있습니다 신경이 될 것입니다 매우 다른 전후방 위치에있는 경우조직의 두께에 차이가있다. 최적의 신경 절개는 2 ...

제브라 피쉬 때문에 그들의 광학 투명 신경계의 발달을 연구하고 transgenesis의 용이성, 그 결합 할 때, 생활 배아에서 동적 세포 행동의 멋진 영상을 허용하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 제브라 피쉬와 포유류는 거의 모든 신경계 형성이 모델 생물에서 수집 한 세포 및 분자 정보에 필요한 유전자 공유하기 때문에 또한, 다른 척추 동물 종에 직접 논리적 인 사람이어야합니다. 신경 발달 연구를위한 매우 강력한 있지만, 제브라 피쉬와 독특한 속성은 또한 손상 후 신경 시스템을 유지하고 다시 메커니즘을 규명 할 수있는 잠재력이있다. Zebrafish의 유충 늦은 애벌레 단계로 자신의 반투명을 유지하고 색소 침착을 효과적으로 멜라닌 생산 또는 색소 세포가 부족한 유전자 돌연변이의 약물 억제제의 사용도 함께 차단 될 수 있습니다. 따라서,이 모델 생물을 사용하면 부상 및 regenerat을 연구하는세 동물의 이온이 가능하고, 직접 신경 시스템을 다시 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 독특한 기회를 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 효율적이고 재현성 zebrafish의 애벌레의 PNS의 신경을 손상하는 방법에 대해 설명합니다. 이 부상 패러다임은 주변 glia의 면역 세포의 반응뿐만 아니라, 재생하는 동안이 인구 사이의 상호 작용도 변성뿐만 아니라 공부에 자신을 준다, 그러나. PNS는 유기체가 환경과 상호 작용하고 생존 할 수 있도록, 중추 신경계 (CNS)와 피부, 장기와 신체의 근육 사이에 정보를 전달하는 데 필요한 운동 및 감각 신경의 복잡한 네트워크입니다. 이 신경을 따라 수초가 아닌 수초 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라, 결합 조직, 축삭 넣다 궁극적으로 성숙한 신경을 형성하는 등 주변의 glia. 이러한 신경의 손상이 프로​​세스 K를 시작Wallerian 변성 10 nown. 축삭 분열, 면역 채용, 파편 통관 및 재생이 메커니즘은 매우 틀에 박힌 및 유전자 1 규제이다. 포유류 시스템의 이전 연구는 신경 변성 및 재생 1, 2, 6, 8시 슈반 세포의 역할을 설명했습니다. 고정 된 조직 또는 세포 배양의 이러한 연구에서는 슈반 세포뿐만 아니라 파편 정리에 도움이 상해 사이트에 대식 세포를 모집뿐만 아니라, 수초의 식균 작용 자체 주었. 이러한 연구는 매우 유익하고 있지만, 우리는 실시간으로 생체 내 말초 축삭 손상에 대한 시각 신경교 반응하기 전에 적이없는, 그리고 다른 연구는 이러한 이벤트 기간 동안 주변 교세포의 다른 클래스 사이의 관계를 조사 없다. 최근, 여러 실험실 우리가 여기서 설명하는 것과 유사한 제브라 피쉬와 레이저 매개 축삭 손상을 사용 Wallerian 변성을 조사했습니다 <sup&gt; 4, 5, 7, 9. 이러한 연구의 일부, 피상적 인 감각 축삭은 사용자 지정 내장, 두 광자 공 초점 현미경 4, 5, 9를 사용하여 어린 유충에 axotomized 하였다. 또 다른 연구에서, 이는 우리 자신과 매우 유사하다, 복부 운동 신경에서 깊은 축삭은 상업적으로 이용 가능한 레이저 제거 시스템 7을 사용 오일 오래된 유충에 그었 하였다. 이러한 실험 셋업 모두에 초점을 Wallerian 변성 두 축삭과 면역 세포 군데 있었다있었습니다. 이러한 연구를 확장하기 위해, 우리는 더 성숙한, 유수 신경 및 분석 변성과 재생 동안 모든 신경 관련 주변 교세포의 반응을 함께 오래된 애벌레의 모터 축삭 손상 대해 설명합니다. 이렇게하려면, 우리는뿐만 아니라 손상된 축삭을 따라 이러한 집단 간의 상호 작용을 조사하기로 6 운동 신경, 7 일 게시물 수정 (DPF) 유충을 절개 개별 교세포 집단의 반응을 시각화. 더블, 트리플 TRA를 사용하여그 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라 축삭을위한 마커 등의 라벨 주변 아교, nsgenic 라인, 우리는 구성된 시판 레이저 제거 시스템을 사용 질소 펌프 회전 디스크 공 촛점 시스템에 부착 된 염료 레이저 (파장 435 nm의) 축삭 transections을 만들 수 있습니다. 이 실험 셋업 우리가 서로 축삭 손상과의 관계에 특정 주변 장치 모터 축삭 책자 및 시간 경과 이미지 별개의 폐해 인구의 반응을 손상, 라이브, 애벌레 zebrafish의를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 과학적 문제를 해결하기 위해 서로 다른 유전자 변형 라인이나 유전 적 돌연변이로, 다른 나이의 제브라 피쉬의 신경 부상을 만들기 위해 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-100G</td><td></td></tr><tr><td>Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222</td><td>Argent Chemical</td><td>C-FINQ-UE-100G</td><td></td></tr><tr><td>저 융점 아가로 스</td><td>Sigma</td><td>A9414-10G</td><td></td></tr><tr><td>Quad CELLview 세포 배양 접시, 유리 바닥, 멸균, Greiner Bio One</td><td>VWR / Greiner</td><td>89125-444</td><td></td></tr><tr><td>단일 우물 유리 바닥 페트리 접시 35 x 10mm, 12mm 두께</td><td>의 Willco Wells</td><td><a href="http://www.willcowells.com/en/products/willco-dish-glass-bottom-dishes/gwst-3512/" target="_blank">GWSt-3512</a></td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint 레이저 시스템, 모든 구성 요소</td><td>포함 Andor Technology - Quorum Technologies, Inc.를 통해 구매</td><td>2203-SYS</td><td></td></tr><tr><td>마이크로포인트 레이저 쿠르마린 염료(435nm)</td><td>Andor Technology</td><td>MP-27-435-DYE</td><td></td></tr></tbody></table>

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

놀라운 유연성과 가소성을 유지하면서, 일관성, 틀에 박힌 방식으로 외부 자극에 반응 상당히 유동성 장기 시스템에도 신경 시스템은 종종 신체의 하드 와이어드 구성 요소로 설명되어 있습니다. 중추 신경계와는 달리 (CNS), 말초 신경계 (PNS)는 중요한 수리를 할 수있다, 그러나 우리는 단지이 현상을 제어하는​​ 세포와 분자 메커니즘을 이해하기 시작했다. 모델 시스템으로 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 생체 내 이미징 및 유전자 조작에 함께 부부 재생 연구에 전례없는 기회를 가질 수있다. 말초 신경은 아교 세포와 결합 조직의 층에 의해 둘러싸인 축삭으로 구성되어 있습니다. 축삭은 perineurium라는 세포 칼집에 의해 다발에 싸여 차례에 슈반 세포를 수초 또는 비 수초에 의해 ensheathed 있습니다. 부상 다음, 성인 말초 신경 레모 놀라운 능력을 가지고적 축삭 파편과 다시 신경을 분포시키다 목표를 손상. PNS 재생에있는 모든 주변 교세포의 역할을 조사하기 위해, 우리는 여기에 살고 형질 전환 제브라 피쉬의 운동 신경을 axotomize하기 위해 상업적으로 이용 가능한 질소 펌프 색소 레이저를 사용하는 축삭 절개 분석을 설명합니다. 우리는 더 이상 부상 및 제어 신경의 시간 경과 영상에이 실험 커플 방법을 설명합니다. 이 실험 패러다임은 아교 세포의 신경 재생에 재생, 그러나 또한 신경계 복구를 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해명을위한 플랫폼이 될 수있는 역할을 평가하지하는 데 사용할 수 있습니다.

여기에 설명 된 분석은 생체 내에서 축삭 손상에 glial 세포와 다른 신경 관련 세포 집단의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 영화 1이 방법과 glial 세포를 둘러싼의 응답을 사용하여 만든 신경 손상의 예를 보여줍니다. 이 실험은 (nkx2.2a : megfp) 전이에서 수행되었다 전이 (olig2 :는 DsRed) 제브라 피쉬, perineurial의 glia은 EGFP와 모터 뉴런 표현 세포질이 DsRed를 대상으로 멤브레인을 표현하는합니다. 부상은 6 DPF 라이브 제브라 피쉬의 트렁크 모터 신경의 주동이의 돌기를 따라했고, 신경 이후 EGFP와 DsRed를 채널 모두에서 이미지가 시간 경과이었다. 축삭과 아교 세포 행동이 허용 동시 시각화는 즉시 부상을 따라. 그림 1은 여전히 영화 1에서 가져온 정적 시간 점의 이미지를 보여줍니다. ...

말초 신경계 (PNS)가 부상 후 중요한 수리 할 수​​ 있지만, 거의가이 현상을 제어하는​​ 세포 및 분자 메커니즘에 대해 잘 알려져 있습니다. 라이브 형질 전환 제브라 피쉬와 재현 신경 절개 분석하여, 우리는 신경 변성과 재생 중에 동적 아교 세포의 행동을 공부할 수 있습니다.

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

본 절차의 전반적인 목표는 살아있는 제브라피시 유생에서 말초 신경 손상 후 글리아 세포(glial cell)의 행동을 타임랩스 이미지로 촬영하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 제브라피시 유생을 유리 바닥 페트리 접시에 저융점 아가로 고정하고, 해부용 바늘을 사용하여 위치를 잡습니다. 다음으로, 고정된 유생을 공초점 현미경 위에 놓습니다.절단할 신경을 선택하고, 손상되지 않은 신경의 축삭과 글리아 세포 이미지를 획득합니다. 그런 다음 신경을 따라 ROI를 설정하고 레이저를 조사하여 선택된 부위를 절단함으로써 신경 단열을 유도합니다. 마지막으로, 신경 단열 이후 축삭과 글리아 세포의 타임랩스 이미지를 촬영합니다.최종적으로, 타임랩스 공초점 현미경 관찰을 통해 신경 퇴행 및 재생 과정 중의 역동적인 글리아 세포 행동을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 글리아 세포가 신경 손상에 어떻게 반응하는지, 그리고 서로 다른 글리아 하위 유형들이 퇴행 및 재생 과정에서 어떻게 행동을 조율하는지와 같은 재생 및 글리아 세포 생물학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.관심 있는 운동 신경세포와 글리아 세포 유형을 형광으로 표시하는 트랜스젠을 가진 성체 제브라피쉬를 교배하고, 배아를 수정 후 24시간(HPF)까지 배양한 후, 난수(egg water)를 제거하고 1 pH tooth threa 또는 PTU가 포함된 난수로 교체한 뒤 배아를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 이 시점부터 약 96 HPF까지 형광 해부 현미경을 사용하여 원하는 형광 유전자의 발현 여부를 스크리닝합니다. 양성 배아를 신선한 PTU 난수로 옮겨 인큐베이터로 되돌립니다.수정 후 6일(DPF)이 되었을 때, 마운팅을 위한 배아 몇 개를 선택하여 더 작은 접시로 옮깁니다. 접시의 물을 제거하고 즉시 0.02% tricaine PTU egg water로 교체한 후, 약 5분 동안 마취제에서 치어를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 미리 준비한 0.8% low melt agarose 한 방울을 수돗물이 담긴 비커에 넣고 전자레인지에 넣습니다.비커를 식혀 agros 튜브가 만졌을 때 미지근해질 때까지 30초 동안 또는 agros가 다 녹을 때까지 기다립니다. 그다음, 마취된 유충을 35 millimeter 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 접시 내의 물을 제거합니다.그런 다음 즉시 유충이 담긴 접시의 유리 바닥 부분에 찰 때까지 충분한 양의 따뜻한 agar를 덮어줍니다. agar가 굳어짐에 따라 해부용 바늘을 사용하여 유충을 옆으로 눕힙니다. 그 후 유충을 살짝 등 쪽으로 기울여, 유충의 몸이 접시 바닥의 유리에 닿게 합니다. 이는 손상 유도 및 이미징을 위해 필수적입니다.아가로스(agarose)가 응고되어 치어가 고정될 때까지 바늘을 사용하여 치어의 위치를 유지하십시오. 그런 다음 디쉬에 아가로스와 치어가 완전히 잠길 정도로 충분한 양의 trica water를 천천히 피펫팅하여 넣으십시오. 모든 공초점 현미경 장비와 제브라피쉬 트랜스젠(transgene)을 여기시키는 데 적합한 다이오드 레이저, 그리고 질소 펌프 염료 레이저의 전원을 켜십시오.공백 빔 스플리터와 435 nanometer coer 및 염료 셀이 제대로 장착되었는지 확인하십시오. 레이저 감쇠기를 완전히 열고, 63 x 1.2 na 수침 렌즈와 한 면이 거울로 된 유리 슬라이드를 사용하여 이미징 소프트웨어를 실행하십시오. 명시야 조명을 사용하여 거울의 긁힘이나 식각 부위를 찾아 초점을 맞추십시오.이미징 소프트웨어를 사용하여 레이저 보정 및 출력 설정을 제어하는 창의 컴퓨터 화면에서 식각된 부분을 확인하고 초점을 맞춥니다. 메인 툴바에서 펄스 수를 1회로, 감쇠율을 3% transmission으로 설정합니다. 타원 도구를 선택하고 컴퓨터 화면의 이미지를 클릭합니다.단일 원형 ROI를 생성하려면 이 과정을 세 번 더 반복하여 이미지 전체에 네 개의 원형 ROI가 무작위로 배치되도록 합니다. 그다음 레이저를 조사합니다. 레이저가 제대로 작동하고 보정되었다면, 각 원형 ROI 내에 네 개의 작은 점 식각(spot etching)이 생성됩니다. 그런 다음 현미경 스테이지에서 유리 슬라이드를 제거하고 대물렌즈를 세척합니다.레이저 절제술을 이용해 운동 신경을 절단하기 위해 빈 빔 분할기를 100%ILL 빔 분할기로 교체합니다. 대물렌즈에 수침 매질을 한 방울 떨어뜨리고, 접안렌즈와 광시야 조명을 사용하여 고정된 유충이 담긴 디시를 적절한 스테이지 위에 놓고 클립으로 고정합니다. 유충에 초점을 맞추고 운동 뉴런의 위치를 찾습니다.hemi 세그먼트 10에서 20 사이의 신경을 스캔하고 절단할 운동 신경을 선택합니다. 다음으로, 컴퓨터 화면에 해당 신경의 실시간 뷰를 띄웁니다. Z 평면을 선택하고 손상되지 않은 신경의 축삭과 글리아 세포 영상을 획득합니다.그 다음, 5분에서 30분 간격으로 모든 세포 유형의 Z-projection을 캡처할 수 있도록 타임랩스 이미징 설정을 준비합니다. 실험 조건에 따라 100%ILL 빔 스플리터를 제거하고 빈 슬롯으로 교체합니다. 신경의 라이브 뷰로 돌아가 적절한 형광 채널을 사용하여 절단될 축삭을 확인합니다.타원 도구를 사용하여 절제할 영역에 얇은 타원형 ROI를 생성합니다. 그런 다음 레이저 설정을 제어하는 창에서 선택한 영역 내에 더 작은 ROI들을 생성합니다. 펄스 수를 2회로 설정하고 감쇠판(attenuation plate)을 18% 투과율로 설정합니다.그런 다음 선택한 ROI 내에서 레이저를 조사합니다. 10초 이상 기다린 후 절제된 부위의 형광을 다시 확인합니다. ROI가 실제로는 광퇴색된 것임에도 초기에는 절제된 것처럼 보일 수 있으며, 완전한 절단을 달성하기 위해 절제 과정 중에 ROI를 약간 수정해야 할 수도 있다는 점에 유의하십시오.형광이 다시 나타나면 레이저 출력을 높여 레이저를 조사하십시오. R OIS 내에서 형광이 사라지고 10초 이내에 다시 나타나지 않을 때까지 이 과정을 반복하십시오. 어블레이션이 완료되면 타임랩스 이미징을 시작하고, 타임랩스가 완료될 때까지 기다리십시오.이미징 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집하고 각 시점별로 컬러 합성 Z-projection 이미지를 생성합니다. 퀵타임(QuickTime) 무비를 제작하여 축삭과 글리아 세포의 행동을 동시에 분석합니다. 여기서 설명한 분석법은 생체 내(in vivo) 축삭 손상에 대한 글리아 세포 및 기타 신경 관련 세포군들의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.이 방법을 통해 유도된 신경 손상의 예와 주변 글리아 세포의 반응이 여기에 제시되어 있습니다. 이 실험은 신경 주변 글리아(perineural ggl)에서 막 표적 EGFP를 발현하고, 운동 신경세포에서 세포질 DS red를 발현하는 6 DPF 형질전환 제브라피쉬에서 수행되었습니다. 몸통 운동 신경의 주둥이 쪽 돌기(rostral projection)를 따라 손상을 입힌 후, EGFP와 DS red 채널 모두에서 타임랩스 이미징을 진행하였습니다.이를 통해 손상 직후 축삭과 글리아 세포의 행동을 동시에 시각화할 수 있었습니다. 이 이미지들은 타임랩스 영상에서 추출한 정지 시점의 장면들입니다. 점선 타원은 1분 시점에 레이저로 제거한 ROI를 나타냅니다.절단 또는 MPT 이후, 절제된 부위에는 형광이 나타나지 않았으며 손상 구역은 근위부에서 원위부 단단까지 약 3.5 micrometers로 측정되었습니다. 절단 성공 여부는 원위부 신경 단단을 이미지화하여 원위부 축삭의 파편화 및 급격한 제거를 포함한 월러 변성(wallerian degeneration)의 징후를 확인함으로써 판별할 수 있습니다. MPT 120분 후 원위부 단단을 따라 축삭 형광이 관찰되지 않는 것은 해당 축삭들이 실제로 월러 변성을 겪었으며 절단이 성공적으로 이루어졌음을 나타냅니다.레이저 어블레이션 실험을 수행할 때 레이저 출력을 최적의 설정으로 조정하는 것이 매우 중요합니다. 최적의 레이저 출력 설정은 선택한 ROI 내의 신경만을 깨끗하게 어블레이션하며, 레이저 출력이 너무 낮거나 너무 높으면 최적이지 않은 결과가 나타납니다. 여기 보이는 사례는 레이저 출력이 너무 낮은 상태에서 수행된 손상 결과입니다. 레이저를 조사한 후에도 ROI 내에 형광이 남아 있어 불완전한 절단이 이루어졌습니다.반면, 이 그림에서 입증된 바와 같이 레이저 출력이 너무 높으면 매우 큰 절제 부위가 생성되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 레이저 절단 실험을 위해 제브라피시를 고정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 질소 펌프 다이 레이저를 사용하여 절단을 수행하고, 타임랩스 공초점 이미징을 통해 주변 세포의 반응을 평가하십시오.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

여기 우리는 장기적인 영상, 두 광자 이미징 및 조직 손상을 기술하고, 시간 경과 공촛점 이미징에 대한 zebrafish 배아를 장착하는 방법을 설명합니다.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

출처: Lahne, M., et.al. 다광자 현미경에 의한 라이브 셀 이미징을 위한 성체 형질전환 제브라피시 망막 외식의 배양. J. Vis. Exp. (2017)이 비디오는 빛에 의한 광수용체 손상 후 아가로스가 박힌 제브라피시 망막 이식에서 Muller 신경교세포 핵 이동의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 손상된 광수용체에 의해 방출된 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 뮐러 신경교세포(Muller glial cell)를 활성화하여 유사분열 및 신경 전구 생성(neuronal progenitor) 생성을 위해 내핵층과 외핵층을 통한 핵 이동을 유발합니다. 캡처된 이미지는 망막 재생 중 핵 이동과 전구 세포 분화의 역학을 보여줍니다.

제브라피시 망막 재생 중 Muller Glial 핵 이동의 라이브 셀 이미징

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

여기서 우리는 생체 내 최대 애벌레와 청소년 단계에서 제브라피시 배아 뇌를 이미지화하는 방법을 제시합니다. 전기 생리학적 접근법에서 채택된 이 미세침습 절차는 성숙한 뉴런의 세포 및 세포 세포 이하 세부 사항에 대한 액세스를 제공하며 뇌 기능 및 약물 개입을 특성화하기 위한 광유전학 및 신경 약리학과 결합될 수 있습니다.

두개골과 피부 제거에 의해 깨어 얼룩말 물고기 애벌레와 청소년에서 완전히 활성 뇌 조직의 생체 내 이미징

우리는 척추 동물의 뇌 조직을 침범하는 교 모세포종 (GBM) 세포에서 미세 소관 역학의 실시간 이미징을 허용하는 기술을보고합니다. 형광 태그가 부착된 GBM 세포를 투명한 제브라피쉬 뇌에 동종 주입하는 것을 고해상도 생체 내 이미징과 결합하면 현장 암 침범 중에 세포 골격 역학을 측정할 수 있습니다.

제브라피쉬의 뇌를 침범하는 교모세포종 세포의 미세소관 역학의 라이브 이미징

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

제브라피시 유충 신경근 접합부(jebrafish larval neuromuscular junction)는 시냅스 생리학을 연구하기 위한 매력적인 모델입니다. 전기 생리학 및 광학 이미징을 포함한 많은 실험 기술에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 정립 형광 현미경 하에서 pHluorin 기반 프로브를 사용하여 시냅스 전달을 이미징하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

절개된 유충 제브라피쉬의 신경근 접합부에서 시냅스 소포 재활용의 라이브 이미징

배우세요 제브라피쉬에서 말초신경 손상 후 아교세포 역학을 관찰하는 방법입니다. 레이저 절단과 공초점 현미경을 활용하여 신경 퇴행 및 재생 과정에서 세포 반응을 실시간으로 분석할 수 있습니다.

모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

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