Name: Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 배우세요 낭성섬유증 치료제 ivacaftor와 lumacaftor의 동시 분석을 위한 최적화된 HPLC-MS 방법입니다. 이 기술은 약물 동태학 연구와 치료 약물 모니터링에 필수적인 신뢰할 수 있는 고처리량 분석을 제공합니다.

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: J.L. 및 T.V. 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID) 건강의 국가 학회 (R01 AI111965)의 의해 지원 됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 알레르기 국립 연구소와 전염병 또는 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. MC는 호주 NHMRC 교장 연구원입니다. J. L.는 호주 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC) 수석 연구 위원, 그리고 T.V.는 호주 NHMRC 산업 경력 개발 수준 2 연구원은. E.K.S는 ASM (미생물학을 위한 미국 사회)에 대 한 임명된 영 대사 2017 이며 오스트레일리아 대학원 포상에 의해 지원 됩니다. 이 작품의 멜버른에 낭 성 섬유 증 (5-8일 의 8 월 2017)에 Australiasian 회의 12일 에 발표 되었다.

에서 모나 쉬 대학 인간 연구 윤리 위원회 (MUHREC) 윤리에 대 한 승인을 얻은.
 1. 분석 결과의 응용 프로그램: 환자 샘플 컬렉션 <ol><li>때 환자 150 mg ivacaftor 또는 ivacaftor 125 mg /lumacaftor의 그들의 표준 복용량을 소요 하는 시간을 기록 200 밀리 그램.</li>
	<li>참고 아래 환자 혈액 샘플 수집 하는 때 정확한 시간. 
	참고: 24 시간 시간 걸쳐 4-5 샘플을 수집 것이 좋습니다. 안정 상태에서 C 최대 농도 후 달성 될 것입니다 표시 시간 포인트는 2.5-4 h 게시물 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 주입 한 샘플 컬렉션은 가능 하면 &#62; 연속 치료 5 일.</li>
	<li>상용 치료 블루 튜브에 혈액의 4-5 mL 수집.</li>
	<li>전체 혈액의 수집, 후 실 온에 그대로 두면 응고 혈액 수. 
	참고:이 일반적으로 15-30 분 걸립니다</li>
	<li>냉장된 원심 분리기에 4 ° C에서 10 분 1000-2000 x g에서 centrifuging 여 혈전을 제거 합니다. 플라즈마로 결과 상쾌한 지정.</li>
	<li>원심 분리, 다음 즉시 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 깨끗 한 폴 리 프로필 렌 튜브에 상쾌한 (플라즈마)를 전송. 레이블 플라즈마 환자 ID (예를 들어, 환자 1), (예를 들어, ivacaftor-lumacaftor 조합), 관리 약물 튜브 시간과 환자 샘플 수집 (예를 들어, 2.5 h 후 복용량) 했다.</li>
	<li>유지 샘플 2-8 ° C에서 처리 하는 동안. 처리 완료 되 면 저장 샘플에서 &#8211; 20 ° c.</li>
	<li>필요한 경우 샘플 분석 연구소 승인된 택배 발송. 
	참고: 샘플을 드라이 아이스에 도착까지 운송 해야 하 고에 지켜져야 한다 &#8211; 분석까지 80 ° C.</li>
</ol> 2. 준비와 발생 샘플의 처리 및 표준 참고: ivacaftor/lumacaftor 치료에 건강 한 기증자 순진한에서 플라즈마 호주 적십자에서 얻은. 무결성을 보장 하기 위해, 모든 샘플/표준 수집 및 처리 하는 동안 2-8 ° C에 보관 한다. 처리 완료 되 면 저장 샘플에서 &#8211; 20 ° C.
<ol><li>IVA, IVA 카복실산, hydroxymethyl IVA 및 루마 내부 기준에 대 한 참조 될 것입니다 밖으로 무게.</li>
	<li>LC MS 학년 메탄올 100 µ g/mL와 10 µ g/mL에서에서 각 분석 (IVA, M1, m 6와 루마)의 두 개의 독립적인 재고 솔루션 준비. 
	참고: 화합물 벤치탑에 10 일 후에 만료 됩니다.</li>
	<li>갓 준비 각 분석 실행 전에 LC MS 교정 표준 교정 표준 희석에 의해 재고 솔루션 농도 따라 달성 하기 위해 인간 플라스마로: 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 및 10.0 µ g/mL. 이 샘플을 표준 이라고 합니다.</li>
	<li>단백질 침전, 이기 (ACN, LC-MS 학년)에서 0.1% 개미 산 (FA)를 준비 하 고 필요한 때까지 냉장고에 두고 하.</li>
</ol> 3. 발생 샘플 및 표준의 전처리 <ol><li>실내 온도에 equilibrate를 모두 환자와 빈 플라즈마 샘플 수.</li>
	<li>15 각 플라즈마 샘플 혼합 소용돌이 샘플 당 s.</li>
	<li>폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 표준에 대 한 어느 빈 플라즈마 또는 분석에 대 한 환자 샘플의 100 µ L 약 수 전송.</li>
	<li>표준 튜브의 각각에 내부 표준 IVA 추가 (예를 들어, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 및 잠재적인 농도 범위를 커버 하 10.0 µ g/mL), 뚜껑을 닫고 2-3 미 참고 내부 표준에 대 한 소용돌이입니다만 빈 플라즈마에 추가 없고 내부 표준 환자 샘플에 추가 됩니다.</li>
	<li>반복 단계 3.4. 다른 내부 표준 M1, M6, 및 루마.</li>
	<li>뚜껑에 아무 방울은 되도록 짧게 각 튜브 아래로 회전.</li>
	<li>0.1%의 혼합의 추가 200 µ L 플라스마 단백질 침전을 각 관으로 ACN에 FA.</li>
	<li>소용돌이 약 15에 대 한 적극적으로 혼합물 s.</li>
	<li>튜브 냉장고에 10 분 동안 서 서 허용.</li>
	<li>가능 하면 4 ° C에서 10 분 동안 10000 x g에서 원심.</li>
	<li>1.5 mL HPLC 유리병에는 상쾌한의 200 µ L 약 수 13 mm 주사기 필터를 통해 필터링.</li>
	<li>HPLC MS 분석에 대 한 LC MS 유리병에 상쾌한의 전송 100 µ L.</li>
</ol> 4. HPLC MS 분석 참고: 트리플 4 극 자 질량 분석기 (표 1)와 결합 하는 LC-MS 시스템에는 HPLC-MS 분석 수행.
<ol><li>설정 LC-MS 시스템에 자동 샘플러에 예제와 함께 트레이에 놓습니다.</li>
	<li>가드 열에 열을 연결 하 고 LC-MS 시스템에 연결.</li>
	<li>모바일 단계의 두 병을 연결 (a: 병 100 %ACN; 병 b: 0.1% 개미 산 성 물에서) 및 LC-MS 시스템 equilibrate.</li>
	<li>LC MS 프로토콜에는 다음 매개 변수를 통합.
	<ol><li>2:1 비율에서 질량 분 서 계에 들어가기 전에 모바일 단계 흐름을 분할 (낭비: MS 입구).</li>
		<li>수행 물에 100 %ACN 0.1% 개미 산으로 구성 된 모바일 단계를 사용 하 여 0.5 mL/min의 유량에 그라데이션 차입 (시작 지점에서과, v/v). 분석을 통해 모바일 단계의 볼륨 % 변경 유의.</li>
		<li>긍정적인 분무 이온화 모드에서 질량 분 서 계 운영.</li>
		<li>LC MS 설정이 다음과 같습니다 있는지 확인: 이온 스프레이 전압 4.5 kV, 충돌 에너지 295.9 V, 가스 nebulizing: 3 L/min에서 질소; 충돌 가스: 아르곤, 건조 가스 20 L/min 흐름, 전압 3 분기 렌즈:-22 V, desolvation 온도 250 ° C 열 블록 400의 온도 ° c.</li>
		<li>주사 10 µ L 볼륨 샘플 당.</li>
		<li>여러 반응 감시 (MRM)를 사용 하 여 검색 analytes. 모니터 m/z 392.49의 이온 전환 &#8594; 393, m/z 408.49 &#8594; 409, m/z 422.47 &#8594; 423 및 m/z 452.40 &#8594; IVA, IVA M1, IVA M6 및 루마, 453 각각. 
		참고: 새로 최적화 된 메서드는 아직 FDA 기준에 따라 유효성을 완전히 검사.</li>
	</ol></li></ol> 5. 보정 곡선 <ol><li>내부 표준 4 개의 analytes의 각각의 피크 면적 비율의 교정 표준 명목상 농도 사이의 관계를 사용 하 여 각 분석 실행 전에 구문 LC-MS 보정 곡선 LC MS 설정 프로그램 내에서 ivacaftor (IVA M1, IVA M6 또는 루마). 
	참고: 보정 곡선의 건설에 대 한 정확한 단계는 LC MS 장비 사용 중인 모델에 의존 합니다. 이 정보는 장치 설명서에서 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>1/C 2 농도의 상호에 따라 가중치에 의해 선형 최소 제곱 회귀 분석을 수행.</li>
</ol>

<ol><li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-drug+plasma+protein+binding+interactions+of+ivacaftor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">Drug-drug plasma protein binding interactions of ivacaftor.</a> J Mol Recognit. 28 (6), 339-348 (2015).</li>
<li>Solomon, M., Leatte, P. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSolomon%2C+M+%22Treatments+for+Cystic+fibrosis%22">Treatments for Cystic fibrosis</a>. , (2009).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Flume, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+approach+to+lung+disease+in+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical approach to lung disease in patients with cystic fibrosis.</a> Semin Respir Crit Care Med. 30 (5), 505-513 (2009).</li>
<li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis+Homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR.</a> N Engl J Med. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Hadida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+N-%282%2C4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl%29-4-oxo-1%2C4-dihydroquinoline-3-carboxamide+%28VX-770%2C+ivacaftor%29%2C+a+potent+and+orally+bioavailable+CFTR+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Discovery of N-(2,4-di-tert-butyl-5-hydroxyphenyl)-4-oxo-1,4-dihydroquinoline-3-carboxamide (VX-770, ivacaftor), a potent and orally bioavailable CFTR potentiator.</a> J Med Chem. 57 (23), 9776-9795 (2014).</li>
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<li>Holmes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+dawn+for+cystic+fibrosis+disease+modifiers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">False dawn for cystic fibrosis disease modifiers?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (10), 713-714 (2014).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+gating+potentiators%2C+including+VX-770%2C+diminish+DeltaF508-CFTR+functional+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Some gating potentiators, including VX-770, diminish DeltaF508-CFTR functional expression.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>Cholon, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiator+ivacaftor+abrogates+pharmacological+correction+of+DeltaF508+CFTR+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Potentiator ivacaftor abrogates pharmacological correction of DeltaF508 CFTR in cystic fibrosis.</a> Sci Transl Med. 6 (246), 246ra297(2014).</li>
<li>EMA, <a target="_blank" href="http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp?curl=pages/medicines/human/medicines/003954/human_med_001935.jsp&mid=WC0b01ac058001d124">Assessment report ORKAMBI (ivacaftor/lumacaftor) European medicines agency</a>. , (2015).</li>
<li>VERTEX. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Vertex+prescribing+infomation%22">Vertex prescribing infomation</a>. , (2015).</li>
<li>Matthes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+free+drug+concentration+prevents+inhibition+of+F508del+CFTR+functional+expression+by+the+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Low free drug concentration prevents inhibition of F508del CFTR functional expression by the potentiator VX-770 (ivacaftor).</a> Br J Pharmacol. 173 (3), 459-470 (2016).</li>
<li>Schneider, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HPLC+and+LC-MS%2FMS+methods+for+the+analysis+of+ivacaftor%2C+its+major+metabolites+and+lumacaftor+in+plasma+and+sputum+of+cystic+fibrosis+patients+treated+with+ORKAMBI+or+KALYDECO%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chrom+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of HPLC and LC-MS/MS methods for the analysis of ivacaftor, its major metabolites and lumacaftor in plasma and sputum of cystic fibrosis patients treated with ORKAMBI or KALYDECO.</a> J Chrom B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1038, 57-62 (2016).</li>
<li>Su, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+LC-MS%2FMS+method+for+the+quantitation+of+cabozantinib+in+rat+plasma%3A+application+to+a+pharmacokinetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An LC-MS/MS method for the quantitation of cabozantinib in rat plasma: application to a pharmacokinetic study.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 985, 119-123 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이전에 보고 된, 우리의 그룹은 처음으로 개발 및 신속한 검출 및 ivacaftor 및 hydroxymethyl IVA M1 (활성) 및 IVA 카복실산 M6 (비활성); 그것의 주요 대사 산물의 정량화를 위한 HPLC 및 LC MS 메서드를 유효성 검사에 대 한 그리고 lumacaftor 플라즈마와 CF 환자14의 래. 우리의 그룹에 의해 이전 보고 분석 결과 성공적으로 루마, IVA, IVA M1 및 IVA-M6 플라즈마에서의 농도 CF 환자 IVA 150 mg /q12 h와 정상 상태 표준 치료의가 래를 계량 하는 데 사용 됩니다 (라틴어 용어: quaque 12 h; 한 번 모든 12 h) 또는 200 mg /q12 h 루마-125 mg /q12 h IVA 조합14. 대량의 환자 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 우리 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 열 c 8를 사용 하 여 보고 된 방법 최적화 했습니다 (2.6 ...

낭 성 섬유 증 (CF)는 폐, 간, 췌 장 및 췌 장 불충분1, 및 폐 기능 감소 등 진보적인 다 기관 실패를 일으키는 원인이 되는 내장의 외 분 비 점액 분 비와 관련 된 일반적인 유전자 질환 2,3. Ivacaftor (IVA)는 첫 번째 식품 및 의약품 안전 청 (미국 FDA) 및 유럽 의약품 청 (EMA) 승인 낭 성 섬유 증 횡단 막 전도도 레 귤 레이 터 (CFTR) potentiator 마약, 중요 한 생산 입증된 임상 효능 CF 환자 G551D CFTR 베어링의 작은 하위 집합에 위약을 통해 폐 기능에 있는 개선 [위치 551에에서 글리신 (G)은 aspartic 산 (D)로 대체] missense 돌연변이 (CF 인구의 4 ~ 5%)4,5. 이 구두 약 증가 CFTR 채널을 열고, 따라서 염화 이온 흐름을 증가 하 고 CF4,6의 임상 발현에 지도 기본 결함에 관리. 불행히도, IVA monotherapy [위치 508에서 페닐알라닌 (F)의 손실 귀착되는 CFTR 유전자의 프레임 삭제]에서 더 일반적인 homozygous F508del 돌연변이 함께 환자에서 효과적 이다 misfolded CFTR의 50%에서 볼 수 있는 결과 CF 인구7,8.
최근에, FDA 마약 lumacaftor CFTR 교정기 IVA 결합에 대 한 승인을 부여 했습니다. CFTR 채널 활동, potentiates 변조기 (IVA)와 세포 표면에 F508del-CFTR 구출 CFTR 교정기 (lumacaftor, 루마) 결합의 영리한 전략 효과적으로 CF 인구5 의 대부분 치료 창 확장 . 질문 충돌 보고서의 숫자가 그 캐스트 의심 그들의 임상 효능9,10시 등장으로 이러한 약물 그들의 약속을 이행할 것입니다 여부에 남아 있습니다. 또한, 폐 기능에 향상 했다만 겸손 (2.6-4% ivacaftor lumacaftor 조합) 환자 G551D 돌연변이 (10.6-12.5%)8베어링에 IVA monotherapy 달성 성공에 비해. 잠재적인 대립 약물-약물 상호작용 IVA 및 루마 잠재적으로 ivacaftor lumacaftor 조합의 임상 효능을 제한 하는 이상적 미만 pharmacokinetic 속성7,11에서 왔습니다. IVA은는 활성 대사 산물 hydroxymethyl-IVA (IVA M1, M1)를 비활성 양식 IVA-카복실산 (IVA M6, M6)7,12주로 시 토 크롬 P450 효소 (CYP)에 의해 광범위 하 게 대사 된다. CYP3A4 유도 루마, 다른 한편으로, 광범위 하 게 대사 되지 하 고 크게 배설물11에서 변하지 않게 배설 된다. CYP3A4 inducers 유도 시 토 크롬 물질 대사로 ivacaftor (CYP3A4 기판) 농도 감소 될 수 있었다. 또한, IVA 및 루마는 매우 소수 성 분자 그리고 ~ 99%에 바인딩된 플라스마 단백질을 크게 제한 하는 무료 (활성) 약물 농도1,13.
샨 다, 이러한 요소는 ivacaftor lumacaftor 조합의 임상 효능을 제한 하 함께 올 수 있습니다. Ivacaftor-lumacaftor 조합에 대 한 현재 투여에서 최적의 플라즈마 농도 달성 여부 또는 치료 임계값8유지 됩니다 그것은 알 수 없습니다. 현재, 피크 pharmacokinetic 매개에 관한 정보의 부족 및 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor의 정상 상태 플라스마 농도 있다. Ivacaftor와 lumacaftor의 유명한 대사를 감안할 때, 노출 응답 관계의 모니터링 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 치료에 대 한 최적의 복용량 식이요법을 달성 하기 위해 필수입니다. 우리의 그룹은 최근 IVA 및 루마14노출-반응 관계의 모니터링에 대 한 첫 번째 HPLC/LC-MS 방법 게시. 아니 대체 기술은 ivacaftor, 그것의 대사 산물, 및 lumacaftor의 농도 측정의 날짜에 보고 되었습니다. 우리의 그룹은 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 열 그라데이션 용 매 시스템을 사용 하 여 보고 된 방법 최적화 큰 환자 집단의 높은 처리량 분석을 허용 하 고 극적으로 분석 시간을 단축 하는 비용 및 실행 시간을 감소 시킨다.

<table><tbody><tr><td>IVA (고양이#S114)&nbsp;</td><td>SelleckChem (미국).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>루마 (Cat#S1565)&nbsp;</td><td>SelleckChem (미국).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVA-카르복실레이트 (Cat# 510242247CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (캐나다).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>하이드록시메틸-IVA (Cat# 510240849CS)&nbsp;</td><td>Clearsynth (캐나다).&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메탄올 (MeOH, LC-MS 등급),&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴(ACN, LC-MS 등급)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포름산(FA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>삼중-사중극자 Shimadzu 8030 LC-MS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex(2.6 &마이크로; m C8 100 &Aring;; 50 &번; 2.1mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(KrudKatcher Ultrea HPLC 인라인 필터 0.5m 깊이 필터 x 0.004inID).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브(VWR).&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13mm 주사기 필터(0.45 &마이크로; m 나일론, GRACE, USA)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[Phenomenex VEREX, 9 mm, PP, 300 &마이크로; L, PTFE/실리콘 격막].&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 lc-ms/ms 방법

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

결함은 낭 성 섬유 증 횡단 막 전도도 레 귤 레이 터 (CFTR)에 낭 성 섬유 증 (CF), 폐 발현 생명을 위협 하는 질병의 원인입니다. Ivacaftor (IVA)와 ivacaftor-lumacaftor (루마) 조합 활동과 결함이 CFTR 단백질의 밀매를 직접 변조 하는 새로운 획기적인 CF 약 두 있습니다. 그러나, 거기 이다 아직도 pharmacokinetic pharmacodynamic 매개 변수에 대 한 이해의 부족 및 ivacaftor 및 lumacaftor의 약리학 Ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-카복실산, 및 lumacaftor 표준 ivacaftor 또는 ivacaftor lumacaftor 조합 받는 환자에서 생물 학적 체액에서의 농도의 동시 분석을 위한 HPLC MS 기술 치료 이전 되었습니다 우리의 그룹에 의해 개발 및 부분적으로 FDA 표준 유효성 검사. 그러나, 환자 샘플의 많은 수의 높은 처리량 분석을 수 있도록, 우리의 그룹은 최적화 된 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 컬럼을 통해 보고 방법 (2.6 µ m, C8 100 Å; 50 x 2.1 m m)와 그라데이션 용 매 시스템 ( 0-1 분: 40 %B; 1-2 분: 40-70 %B; 2-2.7 분: 70 %B;에서 개최 2.7-2.8 분: 70-90 %B; 2.8-4.0 분: 90 %B 세척; 4.0-4.1 분: 90 40 %B; 4.1-6.0 분: 40 %B 개최) isocratic 차입 대신. 이 연구의 목표는 샘플은 많은 양의 환자 샘플의 분석을 위해 필수적인 당 6 분만에 극적으로 ~ 15 분에서 샘플 당 HPLC MS 분석 시간을 단축 했다. 이러한 획기적인 CF 약물의 노출-반응 관계에 연구에 대 한 상당한 유틸리티 편법 방법이 될 것입니다.

우리는 최근 보고 부분적으로 트리플 4 중 극 LC-MS와 HPLC 검출기 시스템에 FDA 기준에 따라 유효성을 검사 하는 방법 (과 물에 100 %ACN 0.1% 포 름 산으로 구성 된 모바일 단계와 C8 열 (5 µ m, 3.9 m m x 50 m m 아이디)를 사용 하 여 v/v) 1 mL/min의 유량에서. 봉우리의 선형 상관 관계는 모든 대사 산물, ivacaftor, Iva M1, Iva-M6, 및 lumacaftor14에 대 한 인간의 플라즈마에 0.01에서 10 µ g/mL의 농도 범위 관찰 되었다. 이 방법은 여기 최적화 된 극적으로 있도록 LC 보존 시간과, 따라서 많은 양의 임상 샘플의 높은 처리량 분석을 위해 필수적인 분석 결과의 완전 한 실행 시간 감소. 분석 결과 작은 기 공 크기 역 상 크로마토그래피 열만 6 분 ~ 15 분에서 샘플 당 시간을 단축 하는 isocratic 차입 대신 그라데이션 용 매 시스템을 사용 하 여 최적화 되었다. Analytes는 여러...

Ivacaftor와 ivacaftor-lumacaftor는 두 개의 새로운 CF 약물. 그러나, 여전히 그들의 PK/PD 및 약리학에 대 한 이해의 부족이입니다. 우리는 주요 대사 산물, ivacaftor 및 lumacaftor의 동시 분석에 대 한 최적화 된 HPLC MS 기법 제시.

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

본 프로토콜은 혈장 분석을 위한 시료 준비 과정입니다. 시료의 무결성을 보장하기 위해, 모든 시료와 표준물질은 수집 및 처리 과정 동안 2~8°C로 유지해야 함에 유의하십시오. 취급이 완료되면 모든 시료를 -20°C에 보관하십시오.표준물질 조제를 위해, 각 아닐라이드(anilide), ivacaftor, M1 대사체, M6 대사체 및 lumacaftor를 메탄올에 녹여 100 µg/mL와 10 µg/mL 농도의 독립적인 스톡 용액을 각각 두 개씩 준비합니다. 해당 화합물들은 상온 보관 시 10일 후에 만료되므로 주의하시기 바랍니다. 표준물질의 경우, 1.5 mL 폴리프로필렌 미세원심분리 튜브에 인간 혈장 100 µL를 옮깁니다.나머지 모든 샘플에 대해서도 동일하게 진행하십시오. 그런 다음 각 튜브에 내부 표준물질을 첨가합니다. 예를 들어, 준비된 표준물질 중에서 0.01 µg/mL를 선택합니다.이제 이 튜브에는 내부 표준 물질이 첨가된 혈장이 들어 있습니다. 다른 모든 표준 용액에 대해서도 동일하게 진행하십시오. 표준 용액들을 가져와 몇 초간 원심 분리하여 모든 액체가 튜브 바닥에 모이도록 하십시오.나머지 40개의 모든 표준물질에 대해서도 이 과정을 반복하십시오. 환자 샘플의 경우, 환자 샘플 튜브에서 100 µL를 취해 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 실제 환자 샘플에는 내부 표준물질이 첨가되지 않습니다.환자 샘플을 몇 초 동안 원심 분리하여 모든 액체가 튜브 바닥에 모이도록 합니다. 다음 단계들은 샘플과 표준품 모두에 동일하게 적용됩니다. 혈장 단백질을 침전시키기 위해 각 샘플 튜브에 acetonitrile에 녹인 0.1% formic acid 200 microliters를 첨가합니다.모든 표준 물질과 환자 검체에 대해 동일하게 반복합니다. 각 검체를 약 15초 동안 강하게 볼텍싱합니다. 모든 표준 물질과 실제 시료(incurred samples)에 대해 이 과정을 계속 수행합니다.침전을 촉진하기 위해 냉장고에서 10분 동안 방치합니다. 시연을 위해 하나의 샘플과 하나의 표준품만 원심분리하겠습니다. Eppendorf Centrifuge 5430을 사용하여 4°C에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리합니다.이제 상층액을 Phenomenex 바이알에 여과하겠습니다. 이를 위해 미국에서 구입한 0.45 micrometers 나일론 Grace 필터가 장착된 13 millimeter 시린지 필터를 사용하며, 1.5 milliliters를 담을 수 있는 HPLC 바이알에 여과합니다. 여과 후, LC/MS 분석을 위해 상층액 100 microliters를 LC/MS 바이알로 옮깁니다.이제 이 샘플은 분석 준비가 완료되었습니다. 모든 샘플을 바이알 랙에 넣으십시오. 본 실험에서는 트리플 쿼드러폴 질량 분석기가 결합된 Shimadzu 8030 LC/MS 시스템을 사용합니다.분석 전 시스템을 평형 상태로 둡니다. 약 15분이 소요되는 평형 상태에 도달하면, Start 버튼을 누르십시오. 각 대사물질에 대해, 검량 표준물질의 명목 농도에 따른 아닐라이드(anilide)의 피크 면적 비율을 도식화하여 검량선을 작성합니다.검량선의 회귀 방정식을 사용하여 실제 시료 내 anilides의 농도를 계산하십시오. 전형적인 크로마토그램이 이 그림에 나타나 있습니다. Phenomenex Kinetex C8 컬럼에서 100% acetonitrile과 0.1% formic acid 수용액을 이동상으로 사용하여 기울기 용리(gradient elution)를 수행함으로써 최적화된 크로마토그래피 분해능을 얻었습니다.LC 머무름 시간은 다음과 같았습니다. M6의 경우 1분, M1의 경우 1.3분이었습니다.ivacaftor의 경우 1.55분, lumacaftor의 경우 2.3분이었습니다. 모든 공백 혈장 시료에서 두 anilide의 머무름 시간(retention time)에 대한 간섭은 관찰되지 않았으며, ivacaftor와 lumacaftor의 조합으로 인한 간섭 또한 검출되지 않았습니다.많은 양의 환자 시료에 대한 고처리량 분석을 통해, 당사는 기존의 등용리 용리 대신 더 작은 공극 크기의 역상 크로마토그래피 컬럼인 Phenomenex C8 컬럼과 기울기 용매 시스템을 사용하여 기보고된 방법을 최적화하였습니다. 이를 통해 세척 단계를 포함하여 시료당 분석 시간을 6분으로 단축하였습니다. 이 신뢰성 있고 새로운 방법은 생체 시료 내 ivacaftor 및 ivacaftor-lumacaftor 병용 투여의 치료적 약물 모니터링을 위한 단순하고 민감하며 신속한 접근 방식을 제공합니다.약물 효능을 극대화하고 의료 비용을 억제하기 위해 노출-반응 관계를 개발해야 할 필요성이 있음에 따라, CF 환자를 대상으로 증거 기반 치료와 고처리량 분석 기술을 사용하는 임상의를 지원할 수 있는 더 민감한 도구의 개발 및 검증이 필요합니다. 제안된 분석 방법을 임상 약동학 및 약역학 연구에 적용함으로써, 더 많은 환자 집단을 대상으로 ivacaftor 또는 ivacaftor-lumacaftor 병용 투여의 약동학적 파라미터를 추가로 조사할 수 있는 기회가 마련될 것입니다.

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Research

JoVE Journal

Medicine

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

체외 시스템의 신진 대사 능력은 약물 및 독성 물질의 생체 내 변화 및 처분을위한 핵심 요구 사항입니다. 이러한 프로토콜에서는, I는 세포 배양 대사 위상을 평가하기위한 기준 대사 프로브의 적용을 설명한다.

질량 분석 및 Luminogenic 기반의 접근 방법은 단계 I 대사 역량의의 특성을<em&gt; 체외</em&gt; 세포 배양

여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

MZmine으로 구현 된 진단 조각화 필터링은 알려지거나 알려지지 않은 천연 제품의 전체 클래스에 대 한 LC-MS/MS 데이터 집합을 화면에 제공 하는 우아한, 사후 획득 방식입니다. 이 도구는 분석가가 전체 화합물 클래스에 대 한 진단으로 정의 된 제품 이온 및/또는 중립 손실에 대 한 MS/MS 스펙트럼을 검색 합니다.

LC-MS/MS 진단 조각화 필터링을 통한 천연물 발견: Microcystin 분석을 위한 응용

여기에서, 우리는 무세포 단백질 합성 반응에 있는 중앙 탄소 및 에너지 물질 대사에 관련시킨 40의 화합물을 정량화하는 강력한 프로토콜을 제시합니다. 무세포 합성 혼합물은 역상 액체 크로마토그래피를 사용하여 효과적인 분리를 위해 아일린으로 유도한 다음 동위원소로 표시된 내부 표준을 사용하여 질량 분석법에 의해 정량화됩니다.

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

복잡한 약 저항하는 결핵 (DR-TB) 식이요법에 환자의 준수를 분석하는 현재 방법은 부정확하고 자원 집약적 일 수 있습니다. 우리의 방법은 11 DR-TB 약물의 농도에 대한 쉽게 수집하고 저장 매트릭스, 머리를 분석합니다. LC-MS/MS를 사용하여 약물 순임을 더 잘 이해하기 위해 활용할 수 있는 하위 나노그램 약물 수준을 결정할 수 있습니다.

작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증

여기에 설명된 항암세포 배양으로부터 수집된 배지에서 키누레닌 통로(kynurenine, 3-하이드록시키누레닌, 크산, 3-하이드록산, 3-하이드록산산)에서 생성된 4개의 상이한 트립토판 대사산물의 결정 프로토콜이 단일 사각폴 황색술과 결합된 액체 염색체 배양으로부터 수집된다.

암 세포 배양에서 수집된 매체에서 액체 크로마토그래피 질량 분광법에 의해 분석된 선택된 Kynurenines의 동시 정량화

프로토콜은 복잡한 lysate 기반 세포 없는 시스템에서 대사 반응을 연구하기 위한 굴절 지수 또는 질량 분광 검출에 결합된 고성능 액체 크로마토그래피 방법을 설명합니다.

리자테 기반 세포 없는 시스템에서 대사산물 프로파일링을 위한 굴절률 또는 질량 분광 검출에 결합된 액체 크로마토그래피

배우세요 낭성섬유증 치료제 ivacaftor와 lumacaftor의 동시 분석을 위한 최적화된 HPLC-MS 방법입니다. 이 기술은 약물 동태학 연구와 치료 약물 모니터링에 필수적인 신뢰할 수 있는 고처리량 분석을 제공합니다.

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

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