Name: iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 유전자 편집으로 iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현을 복원하는 방법을. Duchenne 근영양증 치료를 위한 자가 세포 치료 가능성을 탐색합니다.

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저자는 공개 할 것이 없다.

듀첸 근이영양증(DMD)은 디스트로핀의 부족을 특징으로 하는 파괴적이고 궁극적으로 치명적인 유전질환으로, 진행성 근육 위축으로 이어지는1,2. 우리의 결과는 CRISPR/Cas9 매개 exon23 결실의 접근법에 의해Dmdmdx iPSC 유래 myogenic 전구 세포에서 복원된 디스트로핀 유전자 발현을 입증한다. 이 방법은 세 가지 장점이 있습니다.
첫째, 우리는 비통합 RNA 벡터를 사용하여Dmdmdx 마우스 유래 진피 섬유아세포로부터 iPSC를 생성하였다. 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터와 같은 iPSCs를 생성하기 위해 다양한 방법이 개발되었으며, 이는 숙주 염색체로 통합되어 재프로그래밍 유전자를 발현하여 안전성 문제를 제기합니다. 플라스미드 벡터, 아데노-관련 바이러스 및 아데노바이러스와 같은 DNA 기반 벡터는 비-통합 방...

Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 가장 일반적인 근 이영양증의 한개이고 전세계 대략 5,000명의 신생아 소년의 1에 영향을 미치는 dystrophin의 부재에 의해 특징입니다1. 디스트로핀 유전자 기능의 손실은 진보적 인 myofibers 변성으로 이어지는 구조적 근육 결함을초래1,2. 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)-매개 유전자 치료 시스템은 마이크로 디스트로핀(μ-Dys)을 이용한 유전자 교체와 같은 디스트로핀 발현을 복원하고 근육 기능을 향상시키는 것으로 시험되었다. 그러나, rAAV 접근법은 기능성 단백질3,4의발현을 유지하기 위해 반복주사를 요구한다. 따라서, 우리는 DMD를 가진 환자에 있는 dystrophin 유전자 발현을 효과적이고 영구적으로 복구할 수 있는 전략이 필요합니다. DMD를 위한 마우스 모델인Dmdmdx 마우스는, 조기 종결 코동을 도입하고 C 말단 디스트로글리칸 결합 도메인이 결여된 비기능성 잘린 단백질을 초래하는 디스트로핀 유전자의 엑소(23)에서 포인트 돌연변이를 갖는다. 최근 연구는 크고 작은동물5,6,7에서정확한 유전자 보정 또는 돌연변이 엑시온 결실에 의해 디스트로핀 유전자 발현을 복원하는 CRISPR/Cas9 기술의 사용을 입증하였다. Long etal.8은 상동성 지향 수리(HDR) 기반 CRISPR/Cas9 게놈 편집에 의해Dmdmdx 마우스 생식선에서 디스트로핀 유전자 돌연변이를 교정하는 방법을 보고했다. 엘 레페이 외9 는 rAAV가 영양 실조 마우스에서 돌연변이 엑슨 23을 효율적으로 소비 할 수 있다고보고했다. 이 연구 결과에서, gRNAs는 비 상동성 끝 접합을 통해 DNA 복구 후에 디스트로핀 발현을 부분적으로 복구하는 이중 좌초된 DNA 중단을 일으키는 원인이 되기 위하여 인트론 20 및 23에서 디자인되었습니다 (NHEJ). 더욱 흥미진진한, Amoasii 등10은 최근 개 모델에서 디스트로핀 발현을 복원하는 데 있어 rAAV 매개 CRISPR 유전자 편집의 효능 및 타당성을 보고했으며, 이는 향후 임상 적용에 필수적인 단계이다.
DMD는 또한 줄기 세포 무질서(11)를일으키는 원인이 됩니다. 근육 손상에 대 한, 주거 근육 줄기 세포 근육 분화 후 죽어가는 근육 세포를 보충. 그러나, 상해 및 수리의 연속적인 주기는 근육 줄기 세포(12)에서텔로미어의 단축으로 이어지고, 줄기 세포 풀의 조기 고갈13,14. 따라서, 디스트로핀 발현을 복원하기 위한 게놈 편집과 자가 줄기 세포 요법의 조합은 DMD 를 치료하기 위한 실용적인 접근법이 될 수 있다. CRISPR/Cas9 기술은 기능적인 근육 재생을 위해 자가 수정된 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 생성하고 면역 거부를 일으키지 않으면서 DMD의 추가 합병증을 예방할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나, iPSCs는 myogenic 전구 세포로 iPSC의 분화에 의해 완화될 수 있던 종양 대형의 리스크가 있습니다.
이 프로토콜에서는Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포를 iPSCs로 재프로그래밍한 다음 CRISPR/Cas9 게놈 삭제에 의한 디스트로핀 발현을 복구하기 위해 비통합 Sendai 바이러스의 사용을 설명합니다. 유전자 형이 나는 에 의해 iPSC에서 Exon23 삭제의 검증 후, 우리는 MyoD 유도 myogenic 분화를 통해 myogenic 선조 (MPC)로 게놈 보정 iPSC를 분화.

<table><tbody><tr><td>외과 기구</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>31게이지 바늘</td><td>다양한&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>날카로운 절개</td><td>다양&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>멸균 메스</td><td>다양한&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핀셋</td><td>다양한&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 배지(전체 배지 100mL용)</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>볼륨</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(55mM)</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.1mL</td></tr><tr><td>항생제 항진균 슬러션 100x</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>1mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High glucose</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>87mL</td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청 특성화</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>L-글루타민 용액</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>TVP 용액(500 mL 완용액)</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>볼륨</td></tr><tr><td>치킨 세럼</td><td>Gibco</td><td>16110-082</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>186 mg</td></tr><tr><td>포스팟 완충 식염수</td><td></td><td></td><td>- 500 mL</td></tr><tr><td>트립신(2.5%)</td><td>Thermo</td><td>15090046</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>mES 성장 배지(완제품 용액 500mL)</td><td>회사</td><td>카탈로그 번호</td><td>볼륨</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올(55mM)</td><td>Gibco</td><td>21-985-023</td><td>0.5mL</td></tr><tr><td>항생제 항진균 슬러션 100x</td><td>CORNING</td><td>MT30004CI</td><td>5mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High glucose</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>408.5mL</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 특성화된</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>75 mL</td></tr><tr><td>L-글루타민 용액</td><td>SIGMA</td><td>G7513</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>마우스 재조합 백혈병 억제 인자(LIF), 0.5 x 106 U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td></td><td>CS210511 500 &mu; L</td></tr><tr><td>MEK/GS3 억제제 보충제</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210510-500UL</td><td>500 &mu; L</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액 (100개)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>ES 세포 배지는 4주 이상 보관해서는 안 되며 억제제와 함께 2주 이상 보관해서는 안 됩니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mES 동결 배지(완용액 50mL용)</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Volume</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td><td>SIGMA</td><td>D6429</td><td>24.9 mL</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 특성화</td><td>HyClone</td><td>SH30396.03</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>마우스 재조합 백혈병 억제 인자 (LIF), 0.5 x 106 U/mL</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>CS210511</td><td>50 &mu; l</td></tr><tr><td>재료/장비</td><td>회사</td> 이름 <td>카탈로그 번호</td><td>RRID</td></tr><tr><td>0.05% 트립신/0.53 mM EDTA</td><td>CORNING</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Thermo scientific</td><td>J19943-k2</td><td></td></tr><tr><td>Accutase 용액</td><td>SIGMA</td><td>A6964</td><td>세포 박리 용액</td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3552L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488-conjugated goat-anti-mouse 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A32723</td><td>AB_2633275</td></tr><tr><td>Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td>AB_2633280</td></tr><tr><td>Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A32732</td><td>AB_2633281</td></tr><tr><td>anti-AFP</td><td>Thermo scientific</td><td>RB-365-A1</td><td></td></tr><tr><td>AB_59574 anti-&alpha;-Smooth 근육 Actin (D4K9N) XP</td><td>CST</td><td>19245S</td><td></td></tr><tr><td>AB_2734735 안티-디스트로핀</td><td>Thermo</td><td>PA5-32388</td><td>AB_2549858</td></tr><tr><td>안티-LIN28A (D1A1A) XP&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8641S</td><td>AB_10997528</td></tr><tr><td>anti-MYH2</td><td>DSHB</td><td>mAb2F7</td><td>AB_1157865</td></tr><tr><td>anti-Nanog-XP</td><td>CST</td><td>8822S</td><td></td></tr><tr><td>AB_11217637 anti-Oct-4A (D6C8T)</td><td>CST</td><td>83932S</td><td>AB_2721046</td></tr><tr><td>anti-Sox2</td><td>abcam</td><td>ab97959</td><td>AB_2341193</td></tr><tr><td>anti-SSEA1(MC480)&nbsp;</td><td>CST</td><td>4744s</td><td></td></tr><tr><td>AB_1264258 anti-TH (H-196)</td><td>SANTA CRUZ&nbsp;</td><td>sc-14007</td><td>AB_671397</td></tr><tr><td>알칼리 인산가수분해효소 생염색제 (500x)</td><td>Thermo</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>블라스티시딘 S</td><td>시그마-알드리치</td><td>203350</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI/Esp3I</td><td>NEB</td><td>R0580L/R0734L</td><td></td></tr><tr><td>카르베니실린</td><td>밀리포어</td><td>205805-250MG</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 IV&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004189</td><td></td></tr><tr><td>Competent Cells</td><td>TakaRa</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit</td><td>Thermo</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>DirectPCR 용해 시약(셀)</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>302-C</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (1 U/mL)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>독시사이클린 염산염</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP26535</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101L</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴 소 혈장</td><td>SIGMA</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; QIAEX II 젤 추출 키트 (500)</td>돼지 껍질에서 추출한 <td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>젤라틴, DAPI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vector</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B (50 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCL Injection</td><td>HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH</td><td>45822</td><td></td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>NEB</td><td>R3142L</td><td></td></tr><tr><td>lenti-CRISPRv2-blast</td><td>Addgene</td><td>83480</td><td></td></tr><tr><td>lenti-Guide-Hygro-iRFP670</td><td>Addgene</td><td>99377</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000 Transfection Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2&nbsp; &nbsp;</td><td>Addgene</td><td>60625</td><td></td></tr><tr><td>LV-TRE-VP16 마우스 MyoD-T2A-dsRedExpress2</td><td>Addgene</td><td>60626</td><td></td></tr><tr><td>마우스 온 마우스 (M.O.M.) 기본 키트</td><td>벡터</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 감소 세럼 매체</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 4,000</td><td>알파 에자르</td><td>AAA161510B</td><td></td></tr><tr><td>폴리브렌</td><td>SIGMA</td><td>TR1003</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide</td><td>CORNING</td><td>CB354688</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR Max Premix</td><td>TakaRa</td><td>R045</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>VIAGEN BIOTECH</td><td>507-PKP</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin Dihydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19453980</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 렌티바이러스 적정 키트</td><td>abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>퀵 라이테이션 키트</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100)</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid RT 역전사 키트</td><td>Thermo scientific</td><td>K1691</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Molecular Research Center, INC</td><td>RN 190</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 반응 버퍼</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>훌륭한 국물 변형</td><td>피셔 바이오 시약</td><td>BP9729-600</td><td></td></tr><tr><td>ViralBoost 시약(500x)</td><td>ALSTEM</td><td>VB100</td><td></td></tr></tbody></table>

ipsc 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 crispr/cas9 기술

CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors

Duchenne 근 이영양증 (DMD)는 궁극적으로 근육 전구 세포의 고갈로 이끌어 내는 dystrophin 유전자에 있는 돌연변이에 기인한 가혹한 진보적인 근육 질병입니다. 클러스터된 정기적으로 연속된 짧은 palindromic 반복/CRISPR 관련 9 (CRISPR/Cas9) 유전자 편집은 디스트로핀 유전자의 발현을 회복시킬 수 있는 잠재력을 갖는다. 자가성 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)-유래 근육 전구 세포 (MPC)는 줄기 / 전구 세포 풀을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방 할 수 있습니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 및 비통합 iPSC 기술의 조합을 도입하여 회복된 디스트로핀 단백질 발현을 가진 근육 선조를 얻습니다. 간략하게, 우리는 Dmdmdx 마우스의 진피 섬유아세포로부터 iPSC 라인을 확립하기 위해 비통합 센다이 벡터를 사용합니다. 그런 다음 CRISPR/Cas9 결실 전략을 사용하여 재프레임된 디스트로핀 유전자의 비상동성 말 결합을 통해 디스트로핀 발현을 복원합니다. 94개의 iPSC 콜로니에서 3개의 콜로니에서 exon23 고갈의 PCR 검증 후, 우리는 근육 분화 조절에 중요한 역할을 하는 주요 전사 인자인 MyoD의 독시사이클린(Dox)-유도 발현에 의해 iPSC를 MPC로 분화합니다. 우리의 결과는 DMD의 처리를 위한 미래 치료를 개발하기 위한 중요한 잠재력을 가지고 있는 iPSC 파생된 MPC에 있는 dystrophin 표현을 복구하기 위하여 CRISPR/Cas9 삭제 전략을 사용하는 타당성을 보여줍니다.

Dmdmdx 피부 섬유아세포 유래 iPSC의 확립. 우리는 통합없는 재프로그래밍 벡터를 사용하여Dmdx 마우스 유래 피부 섬유 아세포로부터 마우스 iPSC를 생성하는 효율성을 입증했습니다. 도 1A는 감염 후 3주에 배아 줄기세포(ESC)와 유사 콜로니의 출현을 입증하였다. 우리는 살아있는 알칼리성 인산염 (AP) 얼룩에 의한 iPSC 유도의 효율을 평가합니다; 도 1B는 FACS 분석에 의한 AP 양성 세포의 백분율이 약 1.8%였다는 것을 보여준다. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 및 SOX2, 마우스 배아 줄기 세포에 대한 다능 마커는 면역형광 염색에 의해 iPSC 콜로니에 대해 양성이었다(도1C). 생체 내에서 iPSCs의 3개의 생식선 분화를 조사하기 위하여는,...

여기서, 우리는Dmdmdx 마우스 유래 피부 섬유아세포로부터 iPSC에서 디스트로핀 발현을 복원하고 Tet-on MyoD 활성화 시스템을 사용하여 iPSC를 myogenic 전구 세포(MPC)로 직접 분화하는 Cas9 기반 exon23 결실 프로토콜을 제시한다.

iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe progressive muscle disease caused by mutations in the dystrophin gene, which ultimately leads to the ...

Duchenne은 근육 전구 세포의 조기 피로를 일으키는 근육 이영양증입니다. 그것은 가장 심각한 근 이영양증 중 하나입니다. 기능성 근육 재생을 촉진하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 유전자 편집을 사용하여 유도 된 다능줄기 세포 유래 근육 전구 세포에서 dystrophin 발현을 복원합니다.CRISPR-Cas9 유전자 편집은 dystrophin 유전자 발현을 복원할 가능성이 있습니다. 자가 iPSC 유래 근육 전구 세포는 줄기 세포 모공을 보충하고 손상을 복구하며 면역 반응을 일으키지 않고 DMD에서 추가 합병증을 예방할 수 있습니다. 근생 전구 세포로 iPS 세포의 상이한 에이전트는 iPS 세포에 있는 종양 재창종의 리스크를 감소했습니다.자백 유도 만능 줄기 세포 유래 근육 전구 세포를 CRISPR-Cas9 매개 유전자 교정과 결합하는 몇몇 치료는 Duchenne 근 이영양증 치료 전략을 유망합니다. 이 기술은 심장, 두뇌 및 혈액 병을 포함하여 자가 줄기 세포를 유전으로 편집하여 많은 선천성 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 이 접근법의 데모가 도전으로 남아 있는 세포 재프로그래밍 및 유전자 편집처리에 있는 경험을 독자에게 제공할 수 있었다는 것을 보여주었습니다.반전 된 현미경에서 감염된 마우스 배아 줄기 세포의 식민지를 검사하십시오. 자체 잉크 오브젝트 마커로 접시 바닥에 식민지를 표시합니다. 기름칠된 복제 링을 적용하여 표시된 세포 식민지를 덮습니다.각 복제 링에 0.05%의 트립신-EDTA 100 마이크로리터를 추가하고 5분간 섭씨 37도의 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다. 이어서, MES 성장 배지의 250 밀리리터를 포함하는 48웰 배양 판에 100 마이크로리터 파이펫 팁으로 소화된 세포를 전송한다. 이산화탄소 5%와 습도 85%로 섭씨 37도 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.70%의 합류를 읽을 때 잘 자란 셀이 있는 우물을 선택하고 TVP 용액 250밀리리터를 추가하여 30분 동안 소화합니다. 그런 다음 각 웰에서 6센티미터 접시로 세포 배양을 옮김합니다. 균일한 기숙사 모양의 클론이 얻어지을 때까지 복제 링과 인큐베이션을 여러 번 반복적으로 적용하십시오.이제 TVP 솔루션의 밀리리터 를 추가하여 준비된 마우스 iPSC를 소화합니다. 세포 배양을 섬유네틴과 젤라틴으로 코팅한 24웰 플레이트로 옮기고 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포가 50%에 도달하면 밀리리터 폴리브레네 당 8마이크로그램을 함유한 신선한 배양 배지 500마이크로리터로 전환합니다.그런 다음, 마우스 iPSCs에 렌티바이러스 입자 용액의 100 마이크로리터를 추가합니다. 37°C에서 3일간 세포를 배양하여 이산화탄소 5%를 증정합니다. 다음으로, 24시간 이내에 반킬 속도로 있는 블라스팅신과 히그로마이신 B의 최소 농도를 결정합니다.밀리리터 블라스티시딘당 2.5 마이크로그램의 미디어를 추가하고 밀리리터 히그로마이신 B당 100 마이크로그램을 세포에 넣고 3일 동안 기다린 후 감염된 세포를 안정화하는 것으로 부착된 세포를 선택합니다. 선택한 마우스 iPSC를 0.5 밀리리터의 TVP 용액으로 소화하고, 새로운 24웰 플레이트에서 각각 잘 소화하고, 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 30분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 iPSC를 단일 셀로 피펫하고 셀 카운팅 챔버로 셀을 계산합니다.약 150개의 소화된 단일 세포를 선택하고 MES 배지로 희석하여 10센티미터 의 접시로 희석하고, 이산화탄소는 섭씨 37도에서 배양합니다. 약 10 일 후, 반전 된 현미경에서, 사용 10 마이크로 리터 멸균 파이펫 팁 단일 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트에 TVP 솔루션의 50 마이크로 리터로 각 식민지를 전송합니다. 섭씨 37도에서 30분간 소화하세요.CRISPR/Cas9 편집 유도 만능 줄기 세포를 수확하는 성공에 는 신뢰할 수 있는 수동 복제 따기가 중요합니다. 그런 다음 소화된 세포를 각각의 다른 2개의 96웰 배양 판으로 옮기고 나눕니다. 섭씨 37도에서 70%까지 배양합니다.70%의 결합에서 세포 콜로니를 사용하면 96웰 플레이트의 배지를 제거하십시오. 각 웰에 1%Proteinase K 용액을 함유한 25개의 리시스 시약을 추가하고 용액을 다른 96웰 PCR 플레이트로 옮습니다. PCR 플레이트를 접착 씰로 밀봉하고 30분 동안 섭씨 55도에서 열 사이클러에 플레이트를 인큐베이션한 다음 45도에서 45도의 섭씨에서 세포를 lyse및 단백질을 해독하고, PCR 튜브에 2개의 마이크로리터, 2DNA 의 마이크로리터 프리클리터 10마이크로리터를 추가했습니다. , DMD Exon23 프라이머의 마이크로 리터 1개.원고에 따라 PCR 반응을 시작합니다. 그런 다음, 2.2 마이크로리터의 적재 버퍼와 함께 제공되는 PCR 반응을 2%아가로즈 젤에 적재한다. 젤을 100~150볼트에서 30분간 실행하고 자외선 아래에서 젤을 검사합니다.이 프로토콜에서는 돌연변이 Exon23 측면에 있는 두 개의 가이드 RNA가 설계되었습니다. Cas9 매개 이중 좌초 휴식 및 비 동종 최종 결합 후 돌연변이 Exon23이 삭제되어 잘린 하지만 기능적인 Dystrophin 생성이 허용되었습니다. 트립신 솔루션의 누출을 방지하기 위해, 우리는 고리의 바닥에 고르게 그리스를 적용해야합니다.CRISPR/Cas9 게놈 편집과 근육 측정기 활성화 시스템의 조합은 유전자 회복 기저 전구 세포를 가진 Duchenne 근 이영양증 환자에서 자가 이식을 위한 안전하고, 실현 가능하고 효과적인 전략을 제공합니다.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

이 프로토콜은 근이영양증 환자로부터 소변 유래 세포를 분리하기 위한 상세한 절차를 수반하며, 센다이 바이러스 형질전환(Sendai virus transduction)을 통한 효율적이고 신속한 재프로그래밍  을 수반합니다.

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

프로토콜은 iCRISPR 플랫폼을 사용 hPSC 돌연변이 라인을 생성하고 설명하는 글루코스 응답 형 β 세포로 hPSCs 차별화. hPSC 지시 분화와 게놈 편집 기술을 결합하면 인간 발달 및 질병 진행의 계보 결정의 역할의 체계적인 분석을위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

인간의 췌장 개발에 리니지의 결정 요인을 들여다보기위한 게놈 편집 및 hPSCs의 감독 차별화

이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기, 선물이 정도 정상 조직적 조상 세포에서 파생 된 exosomes를 이식 하 여 듀 켄 씨 근이 영양 증 쥐에 심장 기능을 개선 하는 프로토콜.

정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes

여기에서는 piggyBac계 공여 플라스미드와 Cas9 nickase 돌연변이체를 이용한 인간 만능줄기세포에서 원활한 유전자 편집을 위한 상세한 방법을 설명한다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4α) 유전자좌의 엑손 8에 2 점 돌연변이가 도입되었다.

원활한 게놈 편집을 사용하여 인간 만능 줄기 세포에 점 돌연변이 도입

이 프로토콜은 근막세포로 피부 섬유아세포의 변환과 근투로의 분화를 설명합니다. 세포주 신경 근육 장애를 가진 환자에서 파생 되 고 병리학 적 메커니즘을 조사 하 고 치료 전략을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다.

신경 근육 장애에 대 한 치료를 조사 하기 위해 Myoblasts에 인간 섬유 아 세포의 직접 재프로그래밍

이 프로토콜은 가이드 RNA의 설계부터 녹아웃 클론의 세포 클로닝 및 특성화에 이르기까지 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃 근세포를 생성하는 방법을 설명합니다.

렌티바이러스 매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발

제시된 방법은 고효율 렌티바이러스 매개 유전자 전달 시스템을 사용하여 L2HGDH 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 안정적으로 발현하는 인간 배아 줄기 세포(hESC) 계통 H9에서 CRISPR 매개 유전자 knockout의 생성을 설명합니다.

CRISPR-Cas9 매개 유전자 결실은 feeder-free 조건에서 배양된 인간 만능 줄기 세포에서 발생합니다.

배우세요 CRISPR/Cas9 유전자 편집으로 iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현을 복원하는 방법을. Duchenne 근영양증 치료를 위한 자가 세포 치료 가능성을 탐색합니다.

iPSC 유래 근육 전조제에서 디스트로핀 발현 복원에 있는 CRISPR/Cas9 기술

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