Name: 작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 작은 모발 샘플에서 LC-MS/MS를 이용하여 11가지 약물 내성 결핵 약물을 정량화하는 방법을. 이 기술은 환자의 치료 순응도를 객관적으로 평가하여 내성 발생을 예방하고 치료 계획을 개선하는 데 도움을 줍니다.

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저자는 케이프 타운 폐 연구소의 대학에서 키에르탄 Dheda 교수, 알리 에스마일 박사, 마리에지 프레토리우스 에게 감사하고 싶습니다 연구를위한 모발 샘플의 수집을 촉진. 저자는 이 연구 참가자들의 기여를 더욱 감사하게 인정한다.

모든 환자는 모발 샘플 수집 전에 서면 으로 통보된 동의를 제공했습니다. 우리는 케이프 타운 대학과 캘리포니아 대학, 샌프란시스코에서 기관 검토 위원회의 승인을 얻었다.
1. 모발 샘플링
<ol><li>서면 으로 동의를 얻으십시오.</li>
	<li>깨끗한 가위를 사용하여 후두 부위에서 약 20-30 개의 두피 모발 가닥을 가능한 한 두피에 가깝게 자른다.</li>
	<li>방향성을 나타내기 위해 머리카락의 말단 주위에 테이프를 놓습니다. 모발 샘플을 알루미늄 호일 정사각형으로 접고 실온에서 보관하십시오. 모발의 말단에 라벨을 붙이면 근위쪽 끝의 추가 취급으로 인한 오염가능성을 방지합니다.</li>
	<li>환자 샘플 외에도 결핵 약을 복용하지 않은 사람으로부터 두피 모발 샘플인 "빈 모발"을 수집합니다. 다량 (각 20 명의 환자 샘플에 대해 30 mg의 빈 머리카락)을 수집합니다.</li>
</ol>2. 약물 추출
<ol><li>비드 튜브에 레이블을 지정합니다. 각 환자 샘플에는 하나의 튜브가 필요합니다. "C0"에서 "C11"까지 12개의 튜브를 레이블로 지정하고 각 12개의 교정 지점에 대해 하나씩 레이블을 지정합니다. 저품질 관리를 위한 튜브, 중간 품질 관리를 위한 튜브 및 고품질 관리를 위한 튜브에 라벨을 붙입니다. 마지막으로 매트릭스 블랭크에 대한 튜브에 레이블을 지정합니다.</li>
	<li>모발 샘플이 들어 있는 알루미늄 호일 사각형을 엽니다. 모발 샘플이 3cm 이상인 경우, 근위쪽 끝에서 3cm로 머리를 자르고 그 근위 부분을 분석에 사용하십시오.</li>
	<li>비드 튜브에 모발 샘플 2 mg의 무게를 달아 주세요.</li>
	<li>16 개의 추가 비드 튜브에 2 mg의 빈 머리카락을 무게. 교정 지점, 품질 관리 및 매트릭스 블랭크로 사용됩니다. 관은 단계 2.8 및 2.9에 표시된 수준에서 약물 기준 표준으로 스파이크되는 것을 제외하고, 환자 견본과 동일한 추출 절차를 따를 것입니다.</li>
	<li>모든 비드 튜브를 균질화에 넣습니다. 속도 6.95 m/s에서 동질화기를 실행.</li>
	<li>내부 표준 믹스를 만들고 샘플에 추가합니다.<ol>
<li>50 mL 부피 플라스크에 ~ 40 mL의 메탄올을 추가하십시오.</li>
		<li>호박색 유리 바이알에서, 메탄올을 용매로 사용하여 표 1에나타낸 내부 표준을 혼합한다. 참고 : 메탄올은 매우 휘발성입니다. 증발로 인한 손실을 방지하기 위해이 과정에서 모든 바이알을 덮어 둡니다.</li>
		<li>이러한 혼합물에서 표 1에 표시된 볼륨을 50mL 체적 플라스크에 추가합니다. 그런 다음 플라스크를 메탄올로 50 mL로 채웁니다.</li>
		<li>캡과 체적 플라스크를 혼합합니다. 매트릭스 블랭크 튜브를 제외하고, 각 분쇄된 모발 튜브에 혼합물의 500 μL을 첨가한다. 매트릭스 빈 튜브에 500 μL 메탄올을 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>참조 표준 믹스를 만듭니다.<ol>
<li>2.7.2단계에서 표에 나타낸 농도를 얻기 위해 메탄올과 함께 다음 약물의 깔끔한 기준 기준을 구성한다. 다음 농도의 1 mL만 필요합니다.</li>
		<li>1768 μL의 메탄올을 바이알에 첨가한 다음 표 2에 나열된 기준 표준의 양을 동일한 바이알에 추가하여 최종 부피를 2mL로 얻습니다. 이 바이알 "Ref Std 믹스 1x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.</li>
		<li>스파이크 100 μL에서 "Ref Std Mix 1x"를 새로운 바이알에서 900 μL 메탄올로 넣습니다. 이 바이알 "Ref Std 믹스 10x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.</li>
		<li>스파이크 100 μL에서 "Ref Std Mix 10x"를 새로운 바이알에서 900 μL 메탄올로 넣습니다. 이 바이알 "Ref Std Mix 100x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.</li>
		<li>"Ref Std Mix 100x"에서 900 μL 메탄올로 스파이크 100 μL을 새로운 바이알에 넣습니다. 이 바이알 "Ref Std Mix 1000x"에 레이블을 지정합니다. 소용돌이.</li>
	</ol></li>
	<li>표 3에기재된 Ref Std Mix의 양을 추가하여 캘리브레이션 곡선 튜브를 스파이크합니다.</li>
	<li>QC 믹스를 생성하고 품질 관리 튜브를 스파이크합니다.<ol>
<li>"QC-E"를 통해 "QC-A"를 5개의 바이알에 표시합니다.</li>
		<li>다음과 같은 양의 메탄올을 5개의 라벨이 붙은 바이알에 추가하십시오. QC-A: 990 μL QC-B: 940 μL QC-C: 950 μL QC-D: 980 μL QC-E: 950 μL 
		 </li>
		<li>2.7.1단계에서 생성된 1 mg/mL 약물 주식을 사용하여 아래에 나열된 특정 바이알에 10 μL을 추가합니다. 0.5 mg/mL에 있는 BDQ 및 CLF 주식의 경우 아래에 나열된 바이알에 20 μL을 추가하십시오. QC-A: PTH QC-B: EMB, CLF, BDQ, PTM QC-C: INH, LFX, LZD, MFX, PZA QC-D: PTH, EMB QC-E: CLF, BDQ, PTM 참고 : 일부 약물은 여러 믹스에 존재합니다.</li>
		<li>바이알을 "QC-A df100"으로 레이블을 지정합니다. QC-A 10 μL을 990 μL 메탄올로 희석합니다.</li>
		<li>바이알을 "낮은 QC 스톡"으로 레이블을 지정합니다. 이 바이알에 1832 μL 메탄올을 첨가하십시오. 아래에 자세히 설명된 QC 믹스의 양을 추가합니다. QC-A df100: 80 μL QC-B: 8 μL QC-C: 80 μL 
		 </li>
		<li>바이알을 "미드 QC 스톡"으로 레이블을 지정합니다. 이 바이알에 760 μL 메탄올을 첨가하십시오. 아래에 자세히 설명된 QC 믹스의 양을 추가합니다. QC-A df100: 800 μL QC-B: 40 μL QC-C: 400 μL 
		 </li>
		<li>바이알을 "높은 QC 스톡"으로 레이블을 지정합니다. 이 바이알에 1376 μL 메탄올을 첨가하십시오. 아래에 자세히 설명된 QC 믹스의 양을 추가합니다. QC-D: 160 μL QC-E: 320 μL MFX, 1mg/mL 재고: 16 μL INH, 1mg/mL 재고: 32 μL LFX, 1mg/mL 재고: 32 μL LZD, 1mg/mL 재고: 32 μL PZA, 1mg/mL 재고: 32 μL 
		 </li>
		<li>스파이크 10 μL 낮은 QC 재고는 낮은 QC 비드 튜브에.</li>
		<li>스파이크 10 μL 미드 QC 스톡을 미드 QC 비드 튜브에 넣습니다.</li>
		<li>스파이크 10 μL 높은 QC 스톡을 높은 QC 비드 튜브에 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>모든 튜브를 37°C에서 2시간 동안 핫 셰이커에 놓습니다. 흔들림은 물이 튜브에 튀지 않을 정도로 느려야합니다.</li>
	<li>셰이커에서 튜브를 제거합니다. 비드 튜브에서 새로운 미세 원심 분리관으로 액체를 옮김. 이러한 미세 원심분리기 튜브에 같은 방법으로 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>오래된 튜브에 500 μL 메탄올을 추가합니다. 캡 과 소용돌이.</li>
	<li>두 번째로 비드 튜브에서 액체를 해당 미세 원심 분리튜브로 옮김을 옮김으로 옮김을 전달합니다. 분쇄 된 머리카락을 옮기는 것은 괜찮습니다. 이것은 결국 원심 분리될 것입니다.</li>
	<li>2,800 x g에서10 분 동안 미세 원심 분리튜브를 .</li>
	<li>조심스럽게 액체를 제거하고 해당 라벨이있는 새로운 원심 분리튜브로 옮김을 옮김하십시오. 헤어 펠릿을 방해하거나 옮기지 않도록 주의하십시오.</li>
	<li>원심분리기 튜브의 액체를 증발하여 32°C에서 건조시다.</li>
	<li>건조 튜브에 200 μL의 이월 상 A (1% 포르믹산이있는 HPLC 등급의 물)를 추가하여 샘플을 재구성합니다. 소용돌이.</li>
	<li>250 μL 인서트가 있는 앰버 바이알로 액체를 옮김.</li>
</ol>3. LC-MS/MS 준비
<ol><li>1리터 의 체적 플라스크에 HPLC 등급의 물을 추가하여 1리터의 이머지 A(1% 포르믹산을 가진 HPLC 급 물)를 만듭니다. 그런 다음 10 mL의 >95% 포름산을 플라스크에 넣고 HPLC 등급의 물로 라인을 채웁니다.<ol>
<li>1리터 부피 플라스크에 아세토니트릴을 추가하여 이머지 B(0.1% 포르믹산을 가진 아세트니트릴)의 1리터를 만드세요. 그런 다음 1 mL의 >95% 포름산을 플라스크에 넣고 아세토니트릴로 라인을 채웁니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2.5 μm 입자 크기와 100 Å 모공 크기의 2 x 100mm 컬럼을 기둥 구획에 다공성 실리카로 완전히 만든 극성 끝뚜껑, 에테르 연결 페닐 비드로 설치합니다. 열에도 제조업체권장 가드 카트리지가 설치되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>데이터 수집 소프트웨어를 열고 하드웨어 구성을 두 번 클릭합니다. LCMS를 강조 표시하고 프로필 활성화를클릭합니다.<ol>
<li>새 하위 프로젝트,또는 다른 하위 프로젝트가 이미 있는 경우 하위 프로젝트 복사를클릭합니다. 하위 프로젝트의 이름을 지정합니다.</li>
		<li>새 문서를 클릭합니다. 두 번 클릭 수집 방법. 수집 메서드 창 에서 질량 스펙을 클릭합니다.</li>
		<li>스캔 유형 드롭다운을 MRM(MRM)으로변경합니다. 극성이 양수로 Positive설정되어 있는지 확인합니다.</li>
		<li>가져오기 목록을 클릭하고 보충 재질에 포함된 .csv 파일 MDR-TB LCMS 메서드 transitions.csv를 선택합니다.</li>
		<li>아래로 스크롤하여 지속 시간을 16.751분으로 설정합니다. 적절한 사이클 시간 및 사이클 수가 자동으로 채워집니다.</li>
		<li>왼쪽 사이드바에서 통합 발코 밸브를클릭합니다. 단계 0의 위치 이름이 A인지 확인합니다. 총 시간(min) 열에서 첫 번째 행의 0.4를 입력하고 두 번째 행에 13을 입력합니다.</li>
		<li>위치 열에서 행을 B로 설정하고 행을 2를 A로 설정합니다.</li>
		<li>왼쪽 사이드바에서 바이너리 펌프를 클릭합니다. 표 4에따라 그라데이션 및 유량 표를 설정합니다.</li>
		<li>왼쪽 사이드바에서 자동 샘플러를 클릭합니다. 주입 량을 10 μL로 변경합니다. 온도 제어를 활성화하고 4 °C로 설정합니다.</li>
		<li>왼쪽 사이드바에서 열 구획을 클릭합니다. 좌우 온도를 50°C로 설정합니다.</li>
		<li>메서드를 닫고 저장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>새 문서를 클릭하고 수집 일괄 처리를 선택하여 일괄 처리를만듭니다. 설정된 이름을 입력하고 드롭다운 표시줄에서 새로 만든 메서드를 선택합니다.<ol>
<li>스프레드시트에서 교정 곡선, 품질 관리, 환자 샘플, 교정 곡선, 품질 관리, 환자 샘플, 교정 곡선, 교정 곡선, 품질 관리 등 이 순서를 따르는 일괄 처리를 만듭니다. 캘리브레이션 곡선, 품질 관리 및 환자 샘플 전후뿐만 아니라 실행의 시작과 끝에 용매 블랭크 주사를 추가합니다. 해석이이이이월을 줄이기 위해 교정 곡선과 고품질 관리 바이알을 주사한 후 적어도 8개의 용매 블랭크 주사를 넣습니다. 참고: 컬럼 나이에 따라 더 많은 용매 블랭크 주사를 추가해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>샘플 이름에 인접한 열에서 해당 바이알에 대한 적절한 자동 샘플러 위치를 입력합니다.</li>
		<li>세트 추가를 클릭합니다. 팝업 창에서 일괄 처리의 샘플 수를 입력합니다.</li>
		<li>샘플 이름과 바이알 위치를 스프레드시트에서 새로 만든 일괄 처리로 복사하여 붙여넣습니다.</li>
		<li>제출 탭으로 이동합니다. Submit</li>
	</ol></li>
	<li>이월상 A와 용매 라인 B에 용매 라인 A를 삽입하여 시스템을 평형화.<ol>
<li>4 mL/min 유량에서 용매 조성을 50% B로 설정합니다. 바이너리 펌프를 켭니다.</li>
		<li>5분 후, 0.3 mL/min로 흐름을 줄입니다. 누출 여부를 확인합니다.</li>
		<li>소프트웨어에서 상단 도구 모음에서 평형을 누릅니다. 시간을 >5분으로 설정하고 확인을누릅니다.</li>
		<li>계측기의 평형이 조정되면 창 오른쪽 하단에 있는 모듈이 녹색으로 나타납니다. 압력이 안정화되었는지 확인한 다음 시작 샘플을클릭하여 일괄 처리를 시작합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>일괄 처리가 완료된 후 정량 소프트웨어를 엽니다. 지팡이 아이콘을 클릭하여 새 결과 테이블을 만듭니다.<ol>
<li>찾아보기를 클릭하여 해당 폴더로 이동한 다음 데이터 파일을 강조 표시하고 오른쪽 을 가리키는 화살표를 클릭하여 데이터를 선택한 영역으로 이동합니다. 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>새 메서드 만들기를 선택하고 새 을 클릭합니다. 입력 새 정량 메서드 이름 및 다음 저장을 누릅니다. Next</li>
		<li>중간 보정 지점의 첫 번째 분사를 선택합니다. 다음을누릅니다.</li>
		<li>눈금은 IS 열의 내부 표준의 모든 전환을 표시합니다.</li>
		<li>참조 표준에 대한 수량자 전환의 경우 IS 이름 열에서 해당 IS를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.</li>
		<li>전환을 스크롤하여 자동으로 선택된 보존 시간이 정확한지 확인합니다. 가우시안 스무딩이 1.5로 설정되어 있는지 확인합니다. 다른 모든 기본 설정은 있는 상태로 유지될 수 있습니다(즉, 노이즈 백분율 100%, 기준 선 하위). 창 2.00 분, 피크 분할 2 점). 참고: 원하는 경우 이 시점에서 자동 통합 매개변수를 수정합니다. 이러한 매개 변수는 악기 설정에 따라 변경되기 때문에, 우리는 여기에 우리의 포함하지 않았습니다.</li>
		<li>마무리를 클릭하여 배치에 정량 메서드를 적용합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>크로마토그램을 보려면 왼쪽 상단을 클릭합니다피크 검토 버튼을 표시합니다. 왼쪽 사이드바를 사용하여 전환을 탐색합니다. 모든 정량자 전환의 각 주입을 스크롤하고 필요한 경우 올바른 피크를 수동으로 통합합니다.<ol>
<li>피크를 수동으로 통합하려면 수동 통합 모드 활성화 버튼을 클릭하고 x 축 또는 y축을 따라 클릭하고 드래그하여 크로마토그램을 확대한 다음 한 기준선에서 다른 기준선으로 선을 그려 피크를 정의합니다. 그림 3은 두 개의 크로마토그램을 보여 주며, 하나는 INH를 가지고 있고, 따라서 수동으로 통합된 크로마토그램이고, 다른 하나는 INH가 없는 것을 나타낸다. 참고: 모든 주사는 동일한 매개 변수를 사용하여 통합되어야 합니다. 피크 너비는 이러한 매개변수를 준수하기 위한 지침을 제공할 수 있지만 피크 너비가 다를 수 있습니다. 피크를 정량화하려면 보존 시간이 해당 분석물의 예상 보존 시간 중 ±0.15 분 이내여야 하며(기준 표준 피크에 의해 정의된 바와 같이), 정성적으로 예상 정량자 대 한 한정자 비율을 갖는 것으로 확인(그림 2와같이), 신호 대 잡음 비율이 10보다 큰 것으로 확인되어야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>샘플 유형 컬럼에서 캘리브레이션 곡선 주입(빈 교정 곡선 주입 제외)을 표준으로설정합니다. 품질 관리 주사를 품질 관리로 설정합니다. 나머지 주사를 알 수 없는것으로 둡니다. 참고: 모든 전환에서 설정됩니다.</li>
	<li>실제 농도 열에서 모든 교정 곡선 및 품질 관리 주사에 대해 표 5에 있는 농도를 입력합니다.</li>
	<li>왼쪽 상단에서 두 번째를 클릭보정 곡선 버튼을 표시합니다. 회귀 버튼을 클릭합니다.</li>
	<li>가중치 유형을 1/x로 설정하고 확인을누릅니다.</li>
	<li>교정 곡선과 품질 관리 샘플을 검증하여 배치가 성공적으로 실행되었는지 확인합니다.<ol>
<li>각 수량자 기준 전이(내부 표준 전환 아님)에 대해 각 교정 곡선 주입 정확도(정확도 열)를 살펴봅니다. 교정 점의 3분의 2 이상이 80-120% 이내의 정확도를 가져야 합니다.</li>
		<li>예상 정확도를 훨씬 벗어난 교정 지점의 경우 사출이 이상값일 수 있습니다. 계산된 농도가 해당 바이알의 다른 두 주사에서 2개 이상의 표준 편차인 경우 이상값을 제외합니다. 각 크로마토그램 위에'찾을 수 없는 버튼'을 클릭합니다.</li>
		<li>보정 곡선 위에 표시된 R 값이 >0.975인지 확인합니다.</li>
		<li>모든 품질 관리 주사가 80-120% 이내에 정확도가 있는지 확인합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>위의 모든 조건이 충족되면 배치가 통과되고 샘플을 정량화할 수 있습니다. 도구 모음에서 편집을 클릭한 다음 전체 테이블 복사를클릭합니다. 스프레드시트에 테이블을 붙여넣습니다.</li>
	<li>두 샘플 주사의 계산된 농도의 평균을 취하여 각 샘플의 보고된 농도를 결정합니다.</li>
</ol>

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</ol>

이 작품은 국립 알레르기 및 전염병 연구소 RO1 AI123024 (공동 파이 : 존 멧칼프와 모니카 간디)에 의해 지원되었다.

우리는 LC-MS/MS를 사용하여 작은 모발 샘플에서 DR-TB 치료에 활용된 11가지 항결핵 약물을 정량화하기 위해 개발하고 검증한 방법에 대한 프로토콜을 여기에서 보고합니다. 모발에 있는 이 11개의 약을 정량화하는 그밖 방법은 이전에 개발되고, 검증되고 간행되었습니다. 우리의 방법은 약 3 센티미터 (cm)의 약 20-30 머리 가닥에서 약물의 하위 나노 그램 수준을 정량화 할 수 있으며 이미22mg이 검증되었습니다. 분석된 머리의 낮은 무게는 연구 결과에 관련시킨 환자가 대머리 두피를 노출의 두려움 없이 반복 시험을 위해 신중하게 잠재적으로 돌아올 수 있다는 것을 의미합니다. 우리는 이전에 머리와 DR 처리 결과에 있는 DR-TB 약 수준 사이 협회에 데이터를 간행했습니다23. 따라서, 이러한 다중-매해 패널 방법의 개발 및 검증은 DR-TB 치료 약물 모니터링 분야에서 상당한 진전을 나타낸다.
<p class="jove_cont...

21 세기에, 약 저항하는 결핵 (DR-TB)는 이미 약한 국가 결핵 통제 프로그램에 대한 진화하는 재앙입니다, 확인된 케이스는 전 세계적으로 항균 저항과 관련있는 모든 죽음의 거의 1/3을 차지하는, 지난 5 년 에서만 두 배로,1,,2. DR-TB의 성공적인 치료는 약물 에 민감한 결핵에 대한 치료보다 전통적으로 더 길고 독성이 있는 2차 처방이 요구되고 있다. 더욱이, DR-TB를 가진 환자는 수시로 저항의 출현에 처음에 기여한 준수에 중요한 기존 도전이있습니다 3.
바이러스 성 부하가 처리를 감시하기 위하여 이용될 수 있는 HIV 감염과는 달리, 결핵에 있는 처리 반응의 대리 종점은 개별 수준4에연기되고 믿을 수 없습니다. 환자 준수를 모니터링, 하위 치료 항 결핵 약물 농도 및 치료 실패의 중요한 예측, 또한 도전이다. 자체보고 준수는 리콜 편견과공급자를기쁘게하는 욕망에서 고통5,6. 알약 수 및 약물 치료 이벤트 모니터링 시스템 (MEMS)은 더객관적일 수 있지만 실제 약물 소비를 측정하지 는 않지만8,,9,,10. 바이오 매트릭스의 약물 수준은 준수 및 약물 동력학 데이터를 모두 제공할 수 있습니다. 따라서, 혈장 약물 수준은 일반적으로 치료 약물 모니터링에 사용된다 11,,12. 그러나 약물 준수 모니터링의 맥락에서, 플라즈마 수준은 단기 노출을 나타내며 적절한 준수 기준 범위를 결정할 때 상당한 환자 간 가변성에 의해 제한됩니다. "백색 코트" 효과는, 클리닉 또는 연구 방문 전에 순도가 향상되는 데, 정확한 약물 준수 패턴을 제공하는 혈장 수준의 능력을 더욱 복잡하게 한다13.
모발은 장기간 약물 노출을 측정할 수 있는 대체바이오매트릭스(14,,15)이다. 많은 약물과 내인성 대사 산물은 모발이 성장함에 따라 전신 순환에서 모발 단백질 매트릭스에 통합됩니다. 이 역동적 인 과정이 모발 성장 중에 계속됨에 따라 모발 매트릭스에 증착 된 약물의 양은 순환약물의 지속적인 존재에 따라 달라지므로 모발은 약물 섭취의 훌륭한 시간적 판독입니다. 바이오매트릭스로서의 모발은 혈액에 비해 저장 및 선적을 위한 콜드 체인없이 쉽게 수집할 수 있다는 추가적인 이점이 있다. 또한, 모발은 비생체 위험성이며, 이는 현장에서 추가적인 타당성 이점을 제공한다.
모발 약물 수준은 법의학 응용 프로그램16에서오랫동안 사용되어 왔습니다. 지난 10 년 동안, 머리 antiretroviral (ARV) 수준은 HIV 치료 및 예방에 약물 준수를 평가에 유틸리티를 입증했다, 이는 우리의 그룹이 기여하는. 모발의 ARV,수준은 HIV 감염17,18,,19,20,,21에서치료 결과의 가장 강력한 독립적 인 예측 변수로 나타났다., DR-TB 환자의 모발 수치가 치료 결과를 예측하는 데 동일한 유용성을 가질 지 여부를 결정하기 위해 LC-MS/MS를 사용하여 작은 모발 샘플에서 11개의 DR-TB 약물을 분석하는 방법을 개발하고 검증했습니다. 분석의 성과의 초기 평가로, 우리는 남아프리카 공화국 웨스턴 케이프에 있는 직접 관찰한 치료 (DOT)를 수신하는 DR-TB를 가진 환자의 편의 표본에 있는 DR-TB 약 수준을 측정했습니다22.

<table><tbody><tr><td>2 mL 주사 바이알</td><td>애질런트 테크놀로지스</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>250 uL 주입 바이알 인서트</td><td>애질런트 테크놀로지스</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>비드 러프터 24</td><td>옴니 인터내셔널</td><td>19001</td><td></td></tr><tr><td>비드 파열관 (2 mL 비드 키트, 2.8mm 세라믹, 2 mL 마이크로튜브)</td><td>옴니 인터내셔널</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>베다퀼린</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>B119550</td><td></td></tr><tr><td>베다퀼린-d6</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>B119552</td><td></td></tr><tr><td>클로파지민</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>C324300</td><td></td></tr><tr><td>클로파지민-d7</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>C324302</td><td></td></tr><tr><td>일회용 석회유리 배양관</td><td>VWR</td><td>60825-425</td><td></td></tr><tr><td>에탐부톨</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>E889800</td><td></td></tr><tr><td>에탐부톨-d4</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>E889802</td><td></td></tr><tr><td>에티오나마이드</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>E890420</td><td></td></tr><tr><td>에티오나마이드-d5</td><td>클리어신스</td><td>CS-O-06597</td><td></td></tr><tr><td>개미산</td><td>시그마-올드리치</td><td>F0507-100mL</td><td></td></tr><tr><td>유리병</td><td>코 닝</td><td>1395-1L</td><td></td></tr><tr><td>핫 셰이커</td><td>벨코 글래스 주식회사</td><td>7746-32110</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>애질런트 테크놀로지스</td><td>인피니티 1260</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 아세토니트릴</td><td>니 웰</td><td>015-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 메탄올</td><td>니 웰</td><td>230-1L</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 등급 물</td><td>아쿠아 솔루션즈 주식회사</td><td>W1089-4L</td><td></td></tr><tr><td>이소니아지드</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>I821450</td><td></td></tr><tr><td>이소니아지드-d4</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>I821452</td><td></td></tr><tr><td>LC 기둥, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td><td>현상</td><td>00D-4371-B0</td><td></td></tr><tr><td>LC 가드 카트리지</td><td>현상</td><td>AJ0-8788</td><td></td></tr><tr><td>LC 가드 카트리지 홀더</td><td>현상</td><td>AJ0-9000</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS/MS 정량 소프트웨어</td><td>사이엑스</td><td>멀티퀀트 2.1</td><td></td></tr><tr><td>레보플록사신</td><td>시그마-올드리치</td><td>1362103-200MG</td><td></td></tr><tr><td>레보플록사신-d8</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>L360002</td><td></td></tr><tr><td>리네졸리드</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>L466500</td><td></td></tr><tr><td>리네졸리드-d3</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>L466502</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>E& K 사이언티픽</td><td>695554</td><td></td></tr><tr><td>목시플록사신</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>M745000</td><td></td></tr><tr><td>목시플록사신-13C, d3</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>M745003</td><td></td></tr><tr><td>MS/MS</td><td>사이엑스</td><td>트리플 쿼드 5500</td><td></td></tr><tr><td>OPC 14714</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>O667600</td><td></td></tr><tr><td>프레토마니드 (PA-824)</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>P122500</td><td></td></tr><tr><td>프로티오나마이드</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>P839100</td><td></td></tr><tr><td>프로티오나마이드-d5</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>P839102</td><td></td></tr><tr><td>피라진아마이드</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>P840600</td><td></td></tr><tr><td>피라지나마이드-15N, d3</td><td>토론토 리서치 케미컬</td><td>P840602</td><td></td></tr><tr><td>주사 바이알용 격격 캡</td><td>애질런트 테크놀로지스</td><td>5185-5862</td><td></td></tr><tr><td>터보팹 LV 증발기</td><td>생물산</td><td>103198/11</td><td></td></tr></tbody></table>

작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 lc-ms/ms 패널 검증

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

약물 내성 결핵(DR-TB)은 공중 보건 위협이 증가하고 있으며 치료 약물 수준의 평가는 중요한 임상적 이점을 가질 수 있습니다. 혈장 약 수준은 현재 금 표준 평가입니다, 그러나 phlebotomy 및 감기 사슬을 요구하고, 단지 아주 최근 준수를 붙잡습니다. 우리의 방법은 모발을 사용하여, 쉽게 수집하고 장기 준수의 반사 매트릭스, 11 항 결핵 약물을 테스트합니다. 우리 그룹에 의한 이전 작업은 모발의 항 레트로 바이러스 약물 수준이 HIV 결과와 관련이 있음을 보여줍니다. DR-TB 약물에 대한 우리의 방법은 2 mg의 모발 (뿌리근에 3cm 근위)을 사용하며, 이 모발은 분쇄되어 메탄올로 추출됩니다. 샘플은 단일 LC-MS/MS 방법으로 분석되어 16분 동안 11개의 약물을 정량화합니다. 11개의 약물에 대한 정량화(LLOQs)의 하한은 0.01 ng/mg에서 1 ng/mg에 이르는 범위입니다. 샘플은 약물의 면적 비를 사용하여 정량화되고, 15N-또는 13C 표지된 약물 동위 원소 폴로그. 우리는 0.001-100 ng/mg에 이르는 교정 곡선을 사용했습니다. 직접 관찰 된 치료 (DOT)에 DR-TB 환자로부터 수집 된 모발 샘플의 편의 샘플에 대한 방법의 적용은 11 개의 약물 중 9 개의 선형 동적 범위 내에서 모발의 약물 수준을 나타내고 있습니다 (이소니아지드, 피라진아미드, 에탐부톨, 라인졸리드, 레보플록사신, 목시플로이신, 클로파지민, 베아퀴린, 프리토만). 어떤 환자도 프로티오나미드에 없었고, 에티오나미드에 대한 측정된 수준은 LLOQ에 가까웠습니다(노출 모니터링을 위한 에티오아마이드 대사산물의 적합성을 조사하는 대신 추가 작업). 요약하면, 우리는 약물 내성 결핵 치료 중 치료 약물 모니터링을위한 기술로 머리에 DR-TB 약물에 대한 다중 타액 화 패널의 개발을 설명합니다.

모든 11 DR-TB 약물의 확인 된 수준을 가진 크로마토그램의 그림은 그림 1에나와 있습니다. 각 측정기와 컬럼을 사용할 때 각 측정기의 보존 시간이 변경될 수 있으므로 정확한 보존 시간은 개별적으로 결정해야 합니다.
캘리브레이터 중 하나(DR-TB 약물 기준로 스파이크된 빈 모발 샘플) 중 하나에 대한 특정 약물(이소니아지드, INH)에 대한 추출된 이온 크로마토그램(EIC)은 도 2에나타내었다. 정량자 및 한정자 전이는 정성적 약물의 존재를 확인하는 데 사용됩니다, 수량체의 영역과 한정자의 영역 사이의 비율은 샘플에 걸쳐 일정하게 유지로. 또한 내부 표준을 모니터링하여 각 샘플 주입이 정규화되도록 합니다.
데모를 위해 남아프리카 공화국 웨스턴 케이프에서 DR-TB 약물을 복용한 96명의 총 연구 집단 중 15개의 모발 ...

복잡한 약 저항하는 결핵 (DR-TB) 식이요법에 환자의 준수를 분석하는 현재 방법은 부정확하고 자원 집약적 일 수 있습니다. 우리의 방법은 11 DR-TB 약물의 농도에 대한 쉽게 수집하고 저장 매트릭스, 머리를 분석합니다. LC-MS/MS를 사용하여 약물 순임을 더 잘 이해하기 위해 활용할 수 있는 하위 나노그램 약물 수준을 결정할 수 있습니다.

작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

환자 준수는 매우 도전적이고 약물 대사는 사람에게 사람을 다를 수 있으므로 약물 수준의 객관적인 측정은 결핵 치료 중 저항의 출현을 예방하는 데 중요한 것으로 입증 될 수 있습니다. 준수가 더 정확하고 쉽게 정량화 될 수 있다면, 의료 제공자는 약물 내성의 발달을 제한하는 치료 계획을 개발할 수 있습니다. 우리는 단일 분석에서 작은 모발 샘플 내에서 여러 결핵 약물에 대한 최초의 다중 분석 질량 분석 패널을 개발했습니다.당사의 다중 약물 패널은 환자당 1개의 2밀리그램 샘플만 필요하며 고체 위상 추출 또는 필터링 단계를 사용하여 시료 부피손실을 방지합니다. 치료 과정에서 초기에 측정 된 약물 노출의 객관적인 측정은 잠재적으로 치료 요법에 있는 개별 적인 약에 있는 문제에 임상의를 경고할 수 있었습니다. 모발 샘플은 정확한 약물 농도 수준 측정을 위해 분석 당일 분쇄되어야 합니다.모발 샘플을 채우려면 서면 동의를 얻은 후 얇은 라벨, 참가자 라벨 2개, 가위 한 켤레, 전개된 알루미늄 호일 조각, 알코올 닦기 및 비닐 봉지를 포함한 재료를 준비하십시오. 가위의 칼날을 알코올 닦아로 깨끗하게 닦습니다. 머리 뒤쪽으로 이동하여 원하는 경우 헤어 클립을 사용하여 머리카락의 상단 부분을 들어 올립니다.머리 뒤쪽에서 30가닥의 머리카락을 모아 손으로 대가 를 분리합니다. 가위를 두피에 내리고 머리카락의 바탕을 자른다. 조심스럽게 알루미늄 호일에 머리의 바치를 배치합니다.얇은 라벨을 머리 의 말단 위에 놓고 알루미늄 호일에 단단히 테이핑하십시오. 말단은 두피에서 가장 멀리 떨어진 측면입니다. 알루미늄 호일 조각을 머리 의 위에 접어 알루미늄 호일 위에 참가자 라벨을 놓습니다.접힌 알루미늄 호일 조각을 비닐 봉지에 넣고 다른 참가자 라벨을 비닐 봉지 위에 놓습니다. 모발 샘플에서 약물 추출을 위해 각 모발 샘플2밀리그램을 개별적으로 표지된 비드 튜브에 넣고 빈 모발 샘플 2밀리그램을 16개의 추가 비드 튜브에 넣습니다. 계량 후 모든 비드 튜브를 비드 밀 균질화제에 넣고 매 사이클 사이에 15초의 휴식 기간을 가진 2개의 30초 주기 동안 초당 6.95미터의 속도로 샘플을 균질화합니다.두 번째 균질화 후, 각 샘플에 적절한 내부 표준 믹스의 500 마이크로 리터를 추가하고 매트릭스 빈 튜브에 메탄올의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 테이블에 따라 적절한 참조 표준 믹스의 적절한 볼륨으로 교정 곡선 튜브를 스파이크하고 2 시간 동안 부드러운 흔들림과 37도 수조에 모든 튜브를 배치합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 비드 튜브의 상체를 새로운 라벨이 붙은 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 500 마이크로리터의 메탄올을 비드 튜브에 추가합니다.비드 튜브를 소용돌이시키고 메탄올 세척을 해당 미세 원심 분리튜브로 이송합니다. 원심 분리시 샘플을 조심스럽게 머리 펠릿을 방해하지 않고 새로운 튜브로 슈퍼 네이츠를 전송합니다. 튜브의 액체를 섭씨 32도에서 건조하게 증발시키고 고압 액체 크로마토그래피 등급 의 200 마이크로리터로 샘플을 1 %의 포름산으로 재구성합니다.소용돌이 후 액체 샘플을 250 마이크로리터 인서트가 있는 호박색 바이알로 옮킨다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법의 경우 먼저 2.5 마이크로미터 입자 크기와 100 개의 앙스트롬 모공 크기로 2 ~ 100 밀리미터 컬럼을 설치하여 다공성 실리카로 완전히 만들어진 극성 끝 에톨 비드가 컬럼 구획에 완전히 만들어졌습니다. 컬럼에 제조업체가 권장하는 가드 카트리지가 설치되어 있는지 확인합니다.MDR-TB LCMS 메서드 전환에 포함된 화합물 정보를 복사하여 붙여넣습니다. 질량 사양 창의 상자에 csv 파일. 스프레드시트에서 교정 곡선, 품질 제어, 환자 샘플, 교정 곡선, 품질 제어, 환자 샘플, 교정 곡선 및 품질 제어의 배치 시퀀스를 만듭니다.캘리브레이션 곡선, 품질 제어 및 환자 샘플 전후뿐만 아니라 실행의 시작과 끝에 용매 빈 주사를 추가합니다. 그런 다음 적어도 8개의 용매 블랭크 주사를 교정 곡선및 고품질 관리 바이알에 주사하여 해석물 이월을 감소시킵니다. 일괄 처리가 완료되면 수량 소프트웨어를 엽니다.전환을 스크롤하여 자동으로 선택한 보존 시간이 정확한지 확인하고 Gaussian 스무딩이 1.5로 설정되어 있는지 확인합니다. 다음으로 보정 곡선과 회귀를 표시하고 대기 유형을 x 이상으로 설정합니다. 확인을 클릭하고 교정 곡선 및 품질 관리 샘플을 확인하여 배치가 성공적으로 실행되었는지 확인합니다.각 정량화 참조 별술에 대해 교정 점의 3분의 2 이상이 80-120% 내에 정확도를 가져야 하며 교정 곡선 위에 표시된 R 값이 0.975보다 크다는 것을 확인합니다. 위의 모든 조건이 충족되면 일괄 처리가 통과되고 샘플을 정량화할 수 있습니다. 도구 모음에서 편집을 클릭하고 전체 테이블 복사를 클릭합니다.그런 다음 테이블을 스프레드시트에 붙여 넣고 두 샘플 주사의 계산된 농도의 평균을 사용하여 각 샘플의 보고된 농도를 결정합니다. 여기에 모든 시험 11 약물 내성 결핵 약물의 확인 된 수준을 가진 크로마토그램의 그림을 보여 주었다. 이러한 수치에서, 캘리브레이터 중 하나에서 하나의 특정 약물에 대한 추출된 이온 크로마토그램을 관찰할 수 있다.정량화 및 한정자 전환은 정량화기의 영역과 한정자 영역 사이의 비율이 샘플 전반에 걸쳐 일정하게 유지됨에 따라 약물의 존재를 질적으로 확인하는 데 사용됩니다. 또한 내부 표준은 각 샘플 주입이 정규화되었는지 확인하기 위해 모니터링됩니다. 본 분석에서, 웨스턴 케이프에서 직접 관찰된 치료 조건하에서 약물 내성 결핵 약물을 복용하는 96명의 환자 중 15명의 모발 샘플의 편리한 샘플을 평가했으며, 남아프리카 공화국은 각 분석기마다 가장 낮고 가장 높은 수준의 약물 내성 결핵 약물의 대표적인 수준을 결정하는 것으로 평가되었다.고체 상 추출 또는 필터링 단계가 없는 경우, 상류체를 증발 튜브로 옮길 때 주의하십시오. 튜브로 옮겨진 모든 것은 컬럼에 주입될 수 있습니다. 비드 랩터의 로터가 단단히 나사또는 잠겨 있지 않으면 날아갈 수 있기 때문에 작동하기 전에 로터를 다시 확인하십시오.HIV 분야의 항레트로바이러스와는 대조적으로, 결핵 약물 역학, 준수 및 임상 결과 사이의 관계는 크게 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 우리는 일부 결핵 약물이 모발에 잘 축적되지 않는다는 가설을 가지고 있습니다. 이 약의 대사 산물을 표적으로 하는 것은 참을성 있는 준수의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

증폭 마이크로 어레이 크게 최종 사용자를위한 마이크로 어레이 플로 간소화 단일 챔버로 비대칭 PCR 증폭 및 마이크로 어레이 혼성화를 결합한다. 마이크로 어레이 워크 플로우를 간소화하는 것은 정기적으로 낮은 자원 환경에서 사용할 수있는 마이크로 어레이 기반의 진단 프로그램을 만들기위한 필요한 첫 번째 단계입니다.

다중 약물 내성을 보여<em&gt; 결핵균</em&gt; 증폭 마이크로 어레이

여기에서는 간단한 수동 단백질 침전 단계와 온라인 컬럼 추출을 사용하여 건조된 혈액 반점에서 면역억제제 타크로리무스를 정량화하기 위한 고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(HPLC-MS/MS) 분석에 대해 설명합니다.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

여기 멀티 주입-모 세관에 따라 품질 관리와 향상 된 해상도 및 약물 남용 및 그들의 대사 산물의 대형 패널의 검출에 대 한 허용 하는 포괄적인 약물 감시 하는 높은 처리량 방법 설명 전기 이동 법 질량 분석입니다.

멀티 주입-모 세관 전기 이동 법 질량 분석을 사용 하 여 높은 처리량 및 포괄적인 약물 감시

우리는 가래의 열 불활성화 후에 수행된 결핵 분자 세균성 하중 분석 시험을 기술합니다. 열 불활성화는 가래 샘플을 비감염성으로 만들고 결핵 분자 검사를 위한 봉쇄 수준 3 실험실에 대한 필요성을 없애주게 합니다.

결핵 분자 세균 부하 분석 (TB-MBLA)

이 프로토콜은 긴 판독 시퀀싱 플랫폼을 사용하여 결핵균 의 18개 약물 내성 영역에 대한 표적 심층 시퀀싱에 최적화되었으며, 이어서 장기 판독 데이터용으로 설계된 결핵 특이적 생물정보학 파이프라인으로 분석했습니다.

Long-Read Sequencing Technologies를 사용한 Amplicon Sequencing

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

학습하세요 작은 모발 샘플에서 LC-MS/MS를 이용하여 11가지 약물 내성 결핵 약물을 정량화하는 방법을. 이 기술은 환자의 치료 순응도를 객관적으로 평가하여 내성 발생을 예방하고 치료 계획을 개선하는 데 도움을 줍니다.

작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증

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