Name: 이온 트랩 질량분석법 및 다단계 단편화 분석을 사용한 티베트 의학의 화합물 구조 표준화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 학습하세요 이온 트랩 질량분석법과 다단계 단편화 분석을 활용한 티베트 의학 화합물 구조 분석 방법입니다. Abelmoschus manihot 종자에서 정확한 화합물 식별이 가능하며 천연 의약품 품질 관리에 활용됩니다.

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이 작업은 청두 중의학대학교의 Xinglin Talent Program(No. 030058191), 쓰촨성 자연과학재단(2022NSFSC1470) 및 중국 국립자연과학재단(82204765)의 지원을 받았습니다.

1. 시료 전처리
<ol><li>AMS 샘플 1g을 정확하게 칭량하고 80% 메탄올 30mL와 함께 원뿔형 플라스크에 넣습니다. 혼합물을 초음파 수조 초음파 처리기로 옮겨 25°C에서 30분 동안 추출한다. 샘플을 14,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 참고: 초음파 수조 초음파 처리기의 주파수는 40KHz입니다.</li>
	<li>주입 주사기와 미세 다공성 멤브레인 필터(0.22μm, 유기물만 해당)를 준비합니다. 상청액을 2mL 샘플 병으로 여과합니다.</li>
</ol>2. MS 설정
<ol><li>진공 펌프의 스위치를 켭니다. 아르곤 실린더의 메인 밸브와 분압 밸브를 열고 압력을 약 0.3MPa로 조정합니다. 질소 밸브를 엽니다. 알림: 실험 조건에 충분한 진공도를 보장하기 위해 최소 8시간 동안 기다리십시오. 분석하기 전에 아르곤과 질소의 가스 압력이 충분히 높은지 확인하십시오.</li>
	<li>MS 제어 소프트웨어를 실행합니다. 소프트웨어 패널에서 가열된 SEI 소스를 클릭하고 히터 온도(350°C), 피복 가스 유량(35arb), 보조 가스 유량(15arb), 스프레이 전압(포지티브 모드의 경우 3.8KV, 네거티브 모드의 경우 -2.5KV) 및 모세관 온도(275°C). Apply(적용 ) 버튼을 클릭하여 이온 소스를 활성화합니다.</li>
</ol>3. LC prerun, 분석법 수립 및 MS 획득
<ol><li>이동상 A와 이동상 B는 각각 0.1% 포름산 수용액과 순수한 아세토니트릴을 사용하여 준비합니다. 초음파 수조 초음파 처리기에서 최소 15분 동안 가스를 제거합니다. 용액을 각각 A 및 B 유체 통로에 연결합니다(그림 1A). 메탄올-물(1:9 v/v) 용액을 준비한 다음 펌프와 인젝터의 세척액에 손으로 채웁니다. 참고: 초음파 수조 초음파 처리기의 주파수는 40KHz입니다.</li>
	<li>LC-MS 제어 소프트웨어를 실행합니다.<ol><li>직접 제어 버튼을 클릭하여 LC 제어판을 엽니다. 펌프 모듈에서 시계 반대 방향으로 퍼지 밸브를 엽니다(그림 1B).</li>
		<li>추가 옵션 버튼을 클릭하여 펌프 설정을 열고 퍼지 매개변수를 5mLmin-1에서 3분 동안 설정합니다. 제거 버튼을 클릭하여 거품 제거를 시작합니다. 그런 다음 퍼지 밸브를 닫습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Prime Syringe, Wash Buffer Loop 및 Wash Needle Externally 버튼을 클릭하여 주사기를 각각 3주기 동안, 루프를 1주기 동안, 바늘을 1주기 동안 헹굽니다. 샘플 병을 샘플러에 넣습니다(그림 1C).</li>
	<li>기기 설정 버튼을 클릭하여 분석법 편집 창을 엽니다. 새로 만들기(New) 버튼을 클릭하여 새로운 LC-MS 기기 분석법을 생성합니다.</li>
	<li>LC 방법에 대한 총 실행 시간을 설정합니다. 그런 다음 분석법 편집 창에서 압력 한계, 총 유량, 유량 구배, 시료 온도, 컬럼 온도 및 준비 온도 델타를 설정하는 값을 입력합니다. 참고: 이동상의 기본 총 유속은 크로마토그래피 컬럼이 없는 경우 컬럼 온도가 50% A 및 50%B인 경우 0.3mL/분으로 일정합니다. 샘플 온도 및 준비 온도 델타의 기본값은 각각 15°C 및 0.1°C입니다. 다른 설정은 사용되는 액체 크로마토그래피 컬럼의 유형에 따라 다릅니다.</li>
	<li>MS 방법에 대해 일반 MS 또는 MSn 실험 유형을 선택합니다. 값을 입력하여 획득 시간, 극성, 질량 범위, 전환 값 번호 및 전환 값 지속 시간을 구성합니다. Save(저장 ) 버튼을 클릭하여 설정을 기기 방법으로 구성합니다. 참고: 크로마토그래피 컬럼이 없는 기본 설정은 다음과 같습니다: 획득 시간, 2분; 극성, 양극 또는 음극; 질량 범위, 100 내지 1,200; 스위치 값 번호, 2; 및 전환 값 지속 시간, 1.99분.</li>
</ol>4. 다단계 질량분석법 운영
<ol><li>시퀀스 설정(Sequence Setup) 버튼을 클릭하여 시퀀스 테이블을 엽니다.<ol><li>표에 샘플 유형, 파일 이름, 경로, 샘플 ID, 기기 방법, 위치 및 주입 부피 정보를 입력합니다.</li>
		<li>Save(저장) 버튼을 클릭하여 시퀀스 테이블을 기록한 다음 Start Analysis(분석 시작) 버튼을 클릭하여 설정을 구현하고 MS 수집을 시작합니다. 참고: 기본 샘플 유형은 알 수 없음으로 선택됩니다. Instrument Method는 3.6단계에서 저장한 Method입니다. 샘플 병은 샘플 룸의 고유한 위치에 배치됩니다. 예를 들어, RA1 은 샘플 룸에서 빨간색 영역의 첫 번째 행에 있는 첫 번째 위치입니다. 기본 주입 부피는 일반적으로 2μL이며, 이는 시료의 농도에 따라 다릅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS 데이터를 데이터 처리 소프트웨어에로드합니다. 기본 피크 크로마토그램(BPI)에서 마우스를 클릭하고 드래그하여 곡선 아래 최대 면적(AUC)이 있는 영역을 선택합니다. 해당 MS 스펙트럼이 동일한 창에 표시됩니다.</li>
	<li>다음 MS/MS 분석을 위한 표적 이온을 선택합니다.<ol><li>메서드 편집 창을 다시 엽니다. MSn 설정 테이블에서 대상 이온의 m/z를 Parent Mass 열의 소수점 이하 한 자리로 설정합니다.</li>
		<li>충돌 모드(Collision mode)를 선택하고 충돌 에너지(CE) 값을 입력합니다. MS/MS 스캔 범위를 설정합니다. 저장 버튼을 클릭하여 MS 분석법을 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다. 시작 버튼을 클릭하여 MS/MS 수집을 시작합니다. 참고: MS/MS 스캔 범위는 표적 모이온의 40%-130%였습니다. CID(Collision-Induced Dissociation) 모드의 기본 CE 값은 35%입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS/MS 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에 로드합니다.<ol><li>MS/MS 스펙트럼에서 가장 강한 단편 이온을 식별하고 m/z 값을 MSn 분석법 목록에 입력합니다. MS n Setting 테이블에서 충돌 모드, CE 값 및 스캔 범위를 포함한 MS3 매개변수를 설정합니다.</li>
		<li>저장 버튼을 클릭하여 MS 분석법을 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다. 시작 버튼을 클릭하여 MS3 획득을 시작합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS3 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에로드합니다. 단계 4.4를 반복하여 MS4 스펙트럼을 얻습니다.</li>
	<li>스펙트럼에서 안정한 단편 이온이 관찰되지 않을 때 MSn 실험을 완료한다.</li>
</ol>5. 수동 MSn 데이터 분석
<ol><li>원시 파일을 두 번 클릭하여 MS에서 MSn까지의 모든 질량 스펙트럼을 엽니다. 이온과 해당 단편 이온 사이의 m/z 차이 값을 수동으로 계산합니다. 참고: 예를 들어, 이온(m/z 617.25)과 해당 단편 이온(m/z 571.28) 사이의 m/z 차이 값은 MS/MS에서 45.97이었고, 이온(m/z 571.28)과 해당 단편 이온(m/z 525.38) 사이의 m/z 차이 값은 MS3에서 45.90이었고, 이온(m/z 525.38)과 해당 단편 이온(m/z 344.93 및 273.16) 사이의 m/z 차이 값은 180.45이고 MS 252.22에서 각각4.</li>
	<li>MS4 결과(MSn의 마지막 레벨)에 따라 "코어" 구조를 수동으로 그립니다. m/z 차이 값을 기반으로 작용기 또는 분자 세그먼트를 사용하여 원래 구조를 수동으로 도출합니다. MSn에서 각 분자 구조에 따라 분자 절단 경로를 수동으로 그립니다. 수동 분자 유도의 예는 대표적인 결과 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, X. -F., Wu, H. -T., Tan, G. -G., Zhu, Z. -Y., Chai, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography+coupled+with+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry+for+qualitative+analysis+of+herbal+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography coupled with time-of-flight and ion trap mass spectrometry for qualitative analysis of herbal medicines.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. 1 (4), 235-245 (2011).</li>
<li>Ou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematically+investigating+the+pharmacological+mechanism+of+Dazhu+Hongjingtian+in+the+prevention+and+treatment+of+acute+mountain+sickness+by+integrating+UPLC%2FQ-TOF-MS%2FMS+analysis+and+network+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Systematically investigating the pharmacological mechanism of Dazhu Hongjingtian in the prevention and treatment of acute mountain sickness by integrating UPLC/Q-TOF-MS/MS analysis and network pharmacology.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 179, 113028(2020).</li>
<li>Kind, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+molecules+using+accurate+mass+MS%2FMS+search%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Identification of small molecules using accurate mass MS/MS search.</a> Mass Spectrometry Reviews. 37 (4), 513-532 (2018).</li>
<li>Phetsanthad, A., Vu, N. Q., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-faceted+mass+spectrometric+investigation+of+neuropeptides+in+Callinectes+sapidus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-faceted mass spectrometric investigation of neuropeptides in Callinectes sapidus.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63322(2022).</li>
<li>Seetaloo, N., Phillips, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond+hydrogen%2Fdeuterium-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+alpha-synuclein+structural+dynamics+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry for the study of alpha-synuclein structural dynamics under physiological conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (184), e64050(2022).</li>
<li>Karas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+uptake+of+platinum-and+ruthenium-based+compound+exposure+in+zebrafish+by+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+with+broader+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dose uptake of platinum-and ruthenium-based compound exposure in zebrafish by inductively coupled plasma mass spectrometry with broader applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e6358(2022).</li>
<li>Chang, H. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uracil-DNA+glycosylase+assay+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Uracil-DNA glycosylase assay by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63089(2022).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+and+identification+of+major+constituents+in+Jitai+tablets+by+high-performance+liquid+chromatography%2Fdiode-array+detection+coupled+with+electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Structural characterization and identification of major constituents in Jitai tablets by high-performance liquid chromatography/diode-array detection coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Molecules. 17 (9), 10470-10493 (2012).</li>
<li>Pang, B., Zhu, Y., Lu, L., Gu, F., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applications+and+features+of+liquid+chromatography-mass+spectrometry+in+the+analysis+of+traditional+Chinese+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The applications and features of liquid chromatography-mass spectrometry in the analysis of traditional Chinese medicine.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2016, 3837270(2016).</li>
<li>Ichou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+activation+time+effects+and+the+internal+energy+distributions+for+the+CID%2C+PQD+and+HCD+excitation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of the activation time effects and the internal energy distributions for the CID, PQD and HCD excitation modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 49 (6), 498-508 (2014).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+oligomer+formation+in+glucose+dehydration+by+CO2+and+tetrahydrofuran%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Suppression of oligomer formation in glucose dehydration by CO2 and tetrahydrofuran.</a> Green Chemistry. 19 (14), 3334-3343 (2017).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+effects+on+degradative+condensation+side+reactions+of+fructose+in+its+initial+conversion+to+5-Hydroxymethylfurfural%5BTitle%5D)+AND+%22ChemSusChem%22%5BJournal%5D)">Solvent effects on degradative condensation side reactions of fructose in its initial conversion to 5-Hydroxymethylfurfural.</a> ChemSusChem. 13 (3), 501-512 (2020).</li>
<li>Yang, S., Wang, Z., Zhao, H., Ren, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+research+of+Tibetan+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Traditional+Chinese+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modern research of Tibetan medicine.</a> World Journal of Traditional Chinese Medicine. 5 (2), 131-138 (2019).</li>
<li>Shang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethno-veterinary+survey+of+medicinal+plants+in+Ruoergai+region%2C+Sichuan+province%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Ethno-veterinary survey of medicinal plants in Ruoergai region, Sichuan province, China.</a> Journal of Ethnopharmacology. 142 (2), Sichuan province, China. 390-400 (2012).</li>
<li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcone+derivatives+from+Abelmoschus+manihot+seeds+restrain+NLRP3+inflammasome+assembly+by+inhibiting+ASC+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chalcone derivatives from Abelmoschus manihot seeds restrain NLRP3 inflammasome assembly by inhibiting ASC oligomerization.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 932198(2022).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+out+the+reaction+network+of+humin+formation+at+the+initial+stage+of+fructose+dehydration+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Energy+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Mapping out the reaction network of humin formation at the initial stage of fructose dehydration in water.</a> Green Energy & Environment. , In Press (2022).</li>
<li>Hua, Y., Jenke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+sensitivity+of+an+LC-MS+method+for+screening+material+extracts+for+organic+extractables+via+mobile+phase+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatographic+Science%22%5BJournal%5D)">Increasing the sensitivity of an LC-MS method for screening material extracts for organic extractables via mobile phase optimization.</a> Journal of Chromatographic Science. 50 (3), 213-227 (2012).</li>
<li>Kumar, S., Singh, A., Bajpai, V., Kumar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+characterization+and+distribution+of+monoterpene+indole+alkaloids+in+Rauwolfia+species+by+Orbitrap+Velos+Pro+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Identification characterization and distribution of monoterpene indole alkaloids in Rauwolfia species by Orbitrap Velos Pro mass spectrometer.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 118, 183-194 (2016).</li>
<li>Bayat, P., Lesage, D., Cole, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Ion+activation+in+tandem+mass+spectrometry+using+ultra-high+resolution+instrumentation%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Ion activation in tandem mass spectrometry using ultra-high resolution instrumentation.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 680-702 (2020).</li>
<li>Wu, S. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+determination+of+disulfide+linkages+in+recombinant+therapeutic+proteins+using+online+LC%E2%88%92MS+with+electron-transfer+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric determination of disulfide linkages in recombinant therapeutic proteins using online LC−MS with electron-transfer dissociation.</a> Analytical Chemistry. 81 (1), 112-122 (2009).</li>
<li>Echterbille, J., Quinton, L., Gilles, N., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+mobility+mass+spectrometry+as+a+potential+tool+to+assign+disulfide+bonds+arrangements+in+peptides+with+multiple+disulfide+bridges%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion mobility mass spectrometry as a potential tool to assign disulfide bonds arrangements in peptides with multiple disulfide bridges.</a> Analytical Chemistry. 85 (9), 4405-4413 (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

IT-MS와 MSn 기술은 미량 TCM 화합물의 구조를 식별하는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 단편 이온을 깊이 식별할 수 없는 Q-TOF-MS와 달리 MSn 기술이 적용된 IT-MS는 이온을 분리하고 축적하는 능력으로 인해 탁월합니다. 이 기사에서는 IT-MS 및 MSn 기술을 사용하여 티베트 의학에서 미량 화합물을 식별하는 방법을 간략하게 설명합니다. 상기 방법은 제공된 단편 이온 정보의 양을 결정하기 위해 MS n의n 값을 이용한다. 이 방법의 중요한 단계에는 적절한 스캔 범위를 선택하고 CE 값을 조정하여 귀중한 조각을 식별하는 것이 포함됩니다.
일반적으로 당류의 MSn 분석은 양이온 모드16에서 가장 잘 수행되는 반면, 페놀산 및 알칼로이드는 음이온 모드에서 가장 잘 분석됩니다. ESI 공급원에서 화합물의 반응은 포름산, 아세트산...

중국 전통 의학(TCM)에서 미량 성분의 정성 분석은 연구에서 중요한 주제가 되었습니다. TCM에는 화합물의 수가 많기 때문에 핵자기 공명 분광계(NMR) 또는 X선 회절계(XRD) 분석을 위해 이들을 분리하기가 어렵기 때문에 적은 양의 시료만 필요한 질량 분석법(MS) 기반 방법이 점점 인기를 얻고 있습니다. 또한, MS와 결합된 액체 크로마토그래피(LC)는 복잡한 시료의 분리 및 화합물의 정성 분석을 개선하기 위해 최근 몇 년 동안 TCM 연구에서 널리 사용되었습니다1. 한 가지 일반적인 방법은 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 비행 시간 질량분석법(LC-ESI-TOF-MS)으로, 티베트 의학에 대한 질적 연구에 널리 사용된다2. 이 방법을 사용하면 복잡한 성분이 LC 컬럼에서 농축 및 분리되고 MS 검출기를 사용하여 부가물 이온의 질량 대 전하 비율(m/z)을 관찰할 수 있습니다. 탠덤 MS(MS/MS 또는 MS2) 데이터베이스 검색은 현재 Quadrupole Time-of-Flight(Q-TOF) MS 및 Orbitrap MS3을 사용한 소분자 분석에서 신뢰할 수 있는 화합물 주석을 위한 가장 빠른 접근 방식입니다. 그러나 데이터베이스의 품질이 좋지 않고 다양한 이성질체가 존재하기 때문에 알려지지 않은 화합물의 식별이 방해를 받습니다. 또한, MS/MS 데이터베이스에 의해 제공되는 정보는제한된다(4,5,6,7). 다른 TCM에 널리 적용될 수 있는 일반적인 프로토콜을 사용하여 각 TCM의 화합물을 조사하는 것이 중요합니다.
IT-MS는 링 전극(8)에 상이한 무선 주파수(RF) 전압을 인가함으로써 광범위한 이온을 포획한다. IT-MS는 다양한 연대순으로 시계열 다단계 MS 스캔을 수행하여 성분 다단계 MS(MS n) 단편화를 제공할 수 있으며, 여기서n은 생성 이온 단계9의 수입니다. 선형 IT-MS는 순차적 MSn 실험에 사용될 수 있기 때문에 구조 식별에 가장 적합한 것으로 간주됩니다10. 표적 이온은 선형 IT-MS1에서 분리 및 축적될 수 있습니다. IT-MS의 MS n(n ≥ 3)은 Q-TOF-MS의 MS/MS보다 더 많은 단편 정보를 제공한다. IT-MS는 표적 이온과 그 단편 이온을 잠글 수 없기 때문에 이성질체1을 포함한 미지의 화합물의 구조 규명을 위한 강력한 도구입니다. MSn 기술은 미지의 단백질, 펩타이드 및 다당류의 구조 분석에 널리 적용되어 왔다11,12. MSn의 단편 이온의 풍부도 수준은 Q-TOF-MS의 MS/MS보다 복잡한 샘플의 표적 화합물에 대한 더 많은 분자 단편 정보를 제공합니다. 따라서 TCM의 구조 식별에 MSn 기술을 적용하는 것이 필수적입니다.
티베트 의학은 TCM13의 중요한 구성 요소이며, 이러한 의약품은 주로 고원 지역14에서 발견되는 동물, 식물 및 광물에서 파생됩니다. 티베트 약인 Abelmoschus manihot seeds (AMS)는 Abelmoschus manihot (linn.) medicus의 씨앗입니다. AMS는 아토피 피부염, 류머티즘 및 나병과 같은 상태를 치료하는 데 사용되는 전통 약초입니다. 항균, 항진균, 항암, 항산화, 항염 효과가 있는 칼콘이 함유되어 있다15. 본 연구에서는 MS n 절차를 개선하고, IT-MS 및 MSn을 이용하여 티베트 의약 AMS의 화합물 구조를 규명하기 위한 상세한 방법을 개발하였다. 이온 모드, 스캐닝 범위 및 충돌 모드를 포함한 특정 MS 파라미터는 미량 화합물 식별 문제를 극복하기 위해 최적화되었습니다. 이 연구는 TCM에서 미량 화합물의 표준화된 구조 식별을 촉진하는 것을 목표로 합니다.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrile</td><td>Thermo Scientific</td><td>CAS 75-05-8</td><td>LC-MS 등급</td></tr><tr><td>포름산</td><td>Knowles</td><td>CAS 64-18-6</td><td>HPLC 등급</td></tr><tr><td>선형 이온 트랩 질량 분석기</td><td>Thermo Scientific</td><td>LTQ XL</td><td></td></tr><tr><td>액체 크로마토 그래프</td><td>Thermo Scientific</td><td>U3000</td><td></td></tr><tr><td>LTQ Tune</td><td>Thermo Scientific</td><td>버전 2.8.0</td><td>MS 제어 소프트웨어</td></tr>, <tr><td>메탄올</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>CAS 67-56-1</td>, <td>LC-MS 등급</td></tr>, <tr><td>순수한 물</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>CAS 7732-18-5</td><td>LC-MS 등급</td></tr>, <tr><td>Xcalibur</td>, <td>Thermo Scientific</td><td>버전 : 2.0</td><td>LC-IT-MS 운영 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

이온 트랩 질량분석법 및 다단계 단편화 분석을 사용한 티베트 의학의 화합물 구조 표준화

Standardized Identification of Compound Structure in Tibetan Medicine Using Ion Trap Mass Spectrometry and Multiple-Stage Fragmentation Analysis

티베트 의약품은 복잡하고 알려지지 않은 수많은 화합물을 포함하고 있어 분자 구조에 대한 심층 연구가 중요합니다. 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 비행 시간 질량 분석법(LC-ESI-TOF-MS)은 일반적으로 티베트 의약품을 추출하는 데 사용됩니다. 그러나 스펙트럼 데이터베이스를 사용한 후에도 예측할 수 없는 많은 알려지지 않은 화합물이 남아 있습니다. 본 논문은 이온 트랩 질량 분석법(IT-MS)을 사용하여 티베트 의학의 성분을 식별하는 보편적인 방법을 개발했습니다. 이 분석법에는 시료 전처리, MS 세팅, LC 프리런, 분석법 확립, MS 획득, 다단계 MS 작동 및 수동 데이터 분석을 위한 표준화되고 프로그래밍된 프로토콜이 포함됩니다. 티베트 의약 Abelmoschus manihot 종자의 두 가지 대표적인 화합물은 전형적인 화합물 구조에 대한 상세한 분석과 함께 다단계 단편화를 사용하여 확인되었습니다. 또한 이 기사에서는 이온 모드 선택, 이동상 조정, 스캔 범위 최적화, 충돌 에너지 제어, 충돌 모드 전환, 단편화 요인 및 방법의 한계와 같은 측면에 대해 설명합니다. 개발 된 표준화 된 분석 방법은 보편적이며 티베트 의학에서 알려지지 않은 화합물에 적용 할 수 있습니다.

셀로비오스는 양이온 모드에서 MSn의 타당성을 검증하기 위한 모델로 사용되었다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 셀로비오스[C12H22O11]+의 ESI-MS(양이온 모드)는 m/z 365에서 양성자화된 분자[M+H]+를 생성했습니다. m/z 365에서 [M+H]+의 생성물 이온 스캔(CID-MS/MS)은 m/z 305에서 두 번째 단편 이온을 생성했으며(그림 2B), MS3 및 MS4 분석을 사용하여 추가로 분석되었습니다(그림 2C, D). MS3 분석은 m/z 254에서 세 번째 단편 이온을 생성했고, MS4 분석은 m/z 18...

여기에서 우리는 티베트 의학의 복잡한 천연물 제형(매트릭스)에서 미량과 미량 성분을 식별하는 데 적용할 수 있는 일반적인 프로토콜과 디자인을 설명합니다.

Tibetan medicines are complex and contain numerous unknown compounds, making in-depth research on their molecular structures crucial. Liquid ...

이 방법은 연구자들이 티베트 의약품 화합물의 구조, 특히 나무의 구성 요소를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그것은 자연 의학에서 화합물의 함량에 대한 질적 연구에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은이 경우 얻은 화합물 구조의 정확도가 데이터베이스의 정확도보다 높다는 것입니다.이 기술은 방광이나 소변에서 대사 중간체의 구조 분석에 사용할 수 있습니다. 우선, 티베트 약 Abelmoschus manihot의 씨앗 샘플 준비. AMS 1g을 정확하게 칭량하여 30ml의 80% 메탄올이 들어 있는 원뿔형 플라스크에 넣습니다.40 킬로 헤르츠에서 초음파 수조 초음파 처리기를 사용하여 섭씨 25도에서 30 분 동안 혼합물을 추출하십시오. 그 후, 시료를 14, 000g에서 5분 동안 원심분리한다. 주입 주사기 및 유기 0.22 미크론 미세다공성 멤브레인 필터를 준비하고, 상청액을 2-밀리리터 샘플 병으로 여과한다.진공 펌프의 스위치를 켠 후 부분 압력 밸브와 함께 아르곤 실린더의 메인 밸브를 열고 압력을 약 0.3메가파스칼로 조정합니다. 그런 다음 질소 밸브를 엽니다. 질량 분석법(MS) 제어 소프트웨어를 실행합니다.소프트웨어 패널에서 가열된 ESI 소스를 클릭하고 히터 온도, 가스 유량, 포지티브 및 네거티브 모드의 스프레이 전압, 모세관 온도를 포함한 MS 매개변수를 설정합니다. 적용 버튼을 클릭하여 액체 크로마토그래피 또는 LC용 이온 소스를 활성화합니다.각각 순수한 아세토니트릴의 수용액에서 0.1% 포름산을 사용하여 이동상 A와 B를 준비합니다. 용액을 A 및 B 유체 통로에 각각 연결하기 전에 최소 15분 동안 40킬로헤르츠의 초음파 처리기에서 가스를 제거합니다.1:9 부피 메탄올 물 용액을 준비한 다음 펌프와 인젝터의 세척 유체 병에 수동으로 채웁니다. LC-MS 제어 소프트웨어를 실행한 후 직접 제어를 클릭하여 LC 제어판을 엽니다. 펌프 모듈에서 퍼지 밸브를 시계 반대 방향으로 엽니다.추가 옵션을 클릭하여 펌프 설정을 열고 퍼지 매개변수를 3분 동안 분당 5밀리리터로 설정합니다. 제거를 클릭하여 거품 제거를 시작합니다. 완료되면 퍼지 밸브를 닫습니다.그런 다음 Prime Syringe를 클릭하여 주사기를 3주기 동안 헹구고, Wash Buffer Loop를 클릭하여 루프를 한 주기 동안 헹구고, Wash Needle Externally를 클릭하여 바늘을 한 주기 동안 씻습니다. 샘플 병을 샘플러에 넣습니다. 기기 설정(Instrument Setup)을 클릭하여 분석법 편집 창을 열고 새로 만들기(New)를 클릭하여 새 LC-MS 기기 분석법을 생성합니다.메서드에 대한 총 런타임을 설정하고 압력 한계를 설정합니다. Total Flow rate, flow gradient, sample temperature, column temperature 및 ready temperature delta(분석법 편집 창)의 준비 온도 델타. MS 분석법의 경우 일반 MS 또는 MSn 실험 유형을 선택합니다.획득 시간, 극성, 질량 범위, 전환 값 번호 및 지속 시간의 값을 입력합니다. Save(저장)를 클릭하여 설정을 기기 방법으로 구성합니다. Sequence Setup(시퀀스 설정)을 클릭하여 시퀀스 테이블을 열고 샘플 유형, 파일, 이름, 경로, 샘플 ID, 기기 분석법, 위치 및 주입 부피에 대한 정보를 입력합니다.저장을 클릭하여 시퀀스 테이블을 기록한 다음 설정을 구현하고 MS 수집을 시작합니다. MS 데이터를 데이터 처리 소프트웨어로 로드하려면 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭합니다. 기본 피크 크로마토그램 BPI에서 마우스를 클릭하고 끌어 곡선 또는 AUC 아래의 최대 면적을 선택합니다.해당 MS 스펙트럼이 동일한 창에 표시됩니다. 다음 MS/MS 분석을 위한 표적 이온을 선택합니다. Method Editing Window(분석법 편집 창)를 다시 열고 MSn 설정 테이블에서 대상 이온의 m/z를 Parent Mass(상위 질량) 열의 소수점 이하 한 자리로 설정합니다.그런 다음 충돌 모드를 선택하고 충돌 에너지 또는 CE 값을 입력합니다. MS/MS 스캔 범위를 설정합니다. 저장을 클릭하여 MS 분석법을 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다.시작 버튼을 클릭하여 MS/MS 수집을 시작합니다. 수집이 완료되면 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS/MS 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에 로드합니다. 스펙트럼에서 가장 강한 단편 이온을 식별하고 MSn 방법 목록에 m/z 값을 입력합니다.MSn 설정 테이블에서 충돌 모드, CE 값 및 스캔 범위를 포함한 MS3 매개변수를 설정합니다. 다시 저장을 클릭하여 MS 메서드를 기록하고 시퀀스 테이블에 새 파일 이름을 입력합니다. 시작을 클릭하여 MS3 획득을 시작합니다.앞에서 설명한 대로 탐색기에서 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS3 원시 파일을 데이터 처리 소프트웨어에 로드하고 단계를 반복하여 MS4 스펙트럼을 얻습니다. 데이터를 분석하려면 원시 파일을 두 번 클릭하여 MS에서 MSn까지의 모든 질량 스펙트럼을 엽니다. 이온과 해당 단편 이온 사이의 m/z 차이 값을 수동으로 계산합니다.그런 다음 MS4 결과에 따라 코어 구조를 수동으로 그리고 m/z 차이 값을 기반으로 작용기 또는 분자 세그먼트를 사용하여 원래 구조를 도출합니다. MSn의 각 분자 구조에 따라 분자 절단 경로를 수동으로 그립니다. 모델 탄수화물 셀로비오스의 ESI-MS는 양성 모드에서 m/z 365에서 단백질화된 분자 MH를 생성했습니다.생성물 이온 스캔 또는 CID MS/MS는 m/z 305에서 두 번째 단편 이온을 생성했습니다. 또한, MS3 및 MS4 분석은 각각 m/z 254 및 m/z 185에서 세 번째 및 네 번째 단편 이온을 순차적으로 생성했습니다. MS/MS 분석은 이온 단편화의 순서, 즉 고리 개방 가수분해, CC 절단 및 탈수를 밝혀냈습니다.따라서이 방법은 탄수화물에 적합한 것으로 밝혀졌습니다. LC Q-TOF MS를 이용한 AMS의 예비 정성 분석에서 수많은 미지의 화합물이 존재함을 밝혀냈습니다. m/z(617)에서 MH 이온의 음의 MSn 분석은 m/z(571)에서 제2 단편 이온을 생성하였다.이 단편 이온의 MS3 분석은 32 달톤에 해당하는 메탄올로서의 히드록시에틸과 물로서의 하이드록실(18 달톤)의 손실에 의해 m/z 525에서 세 번째 단편 이온을 생성했습니다. MS4 분석은 m/z 344 및 273에서 네 번째 단편 이온을 생성했습니다. 코어 구조의 수동 식별은 m/z 617에서 화합물의 분자 구조와 MSn에서 절단 경로를 나타냅니다.다른 미지의 화합물의 MH 이온에 대한 생성물 이온 스캔이 수행되었고, 그 분자 구조 및 절단 메커니즘이 또한 밝혀졌다. 진공 펌프를 켠 후 실험 조건에 충분한 진공도를 보장하기 위해 최소 5시간 동안 기다리십시오. 통계 분석은 동일하거나 유사한 질량 대 전하 비율을 갖는 단편을 대조하는 데 사용할 수 있습니다.질량 분석 용액이 증가함에 따라 이 기술은 연구자들이 천연 의약품에서 새로운 화합물을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

이 연구는 분자 네트워킹과 함께 2차원 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법(2D-HPLC-MS) 기술을 활용하여 티베트 약용 식물 Aconitum pendulum Busch(APB)의 복잡한 화학 조성을 밝힙니다. 이 기사는 생약의 복잡한 화학 성분을 체계적으로 탐색하고 식별하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

티베트 의학 Aconitum pendulum 의 구성 요소 식별을 위해 분자 네트워크와 결합 된 2D-HPLC-MS 기술

우리는 고분해능 질량 분석 및 분자 도킹을 중국 전통 의학 연구에서 통합하는 일반 프로토콜에 대해 설명합니다.

Gynura bicolor DC의 화학 성분을 연구하기 위한 고분해능 탠덤 질량 분석법

이 프로토콜은 초고성능 액체 크로마토그래피와 하이브리드 쿼드러폴-오비트랩 고해상도 질량분석법(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)을 결합하여 네트워크 약리학 및 분자 도킹을 결합하여 IgA 신병증(IgAN) 치료를 위한 Yiqi Qingjie 공식(YQQJ)의 물질적 기반을 예측하고 검증하는 방법을 설명합니다.

네트워크 약리학과 통합된 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS를 이용한 IgA 신병증에 대한 Yiqi Qingjie 공식의 물질적 근거 규명

여기서는 다단계 질량분석기와 화향정기(Huoxiang Zhengqi) 경구용 액체를 기반으로 한 단편화 과정을 결합한 표준 프로토콜을 보여줍니다.

선형 이온 트랩 질량분석법을 기반으로 한 화오샹 정기 경구 액체 내 미확인 화합물 구조 분석의 기술적 접근법

이 프로토콜은 효소(엔톡실라나아제) 가수분해 전에 RE에 2개의 아미노벤즈아미드를 태그한 다음 질량 분석법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 결과 올리고당을 분석함으로써 헤테록실란의 말단(RE) 및 내부 영역 글리코실 서열의 구조적 특성화에 사용되는 특정 기술을 설명합니다.

효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속

환경에서 발열성 탄소(PyC)를 평가하기 위한 벤젠 폴리카르복실산(BPCA) 방법을 제시합니다. 화합물 특이적 접근법은 PyC의 특성, 수량 및 동위원소 조성(13C및 14°C)에 대한 동시 정보를 고유하게 제공합니다.

특성, 벤젠 폴리 카르 복실 산을 사용하여 발열 성 탄소의 정량 및 화합물 특정 동위 원소 분석 (BPCA)

실시간 고해상도 질량 분석 다변량 통계 분석을 직접 분석에 의해 식물 재료의 종을 식별하는 방법이 제공된다.

실시간 고해상도 질량 분석에 직접 분석을 사용하여 식물 소재의 신속한 높은 처리량 종 확인

고 분해능 질량 분석 시연 보조 nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간으로 exhaled 호흡의 화학 성분 특성화에 대 한 프로토콜 결합.

고 분해능 질량 분석을 결합 하는 보조 Nanoelectrospray 이온화를 사용 하 여 실시간 호흡 분석

프로토콜은 질량 분석에 의해 올리고 peptoids 시퀀스 분석 다음의 수동 합성에 설명 되어 있습니다.

합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

비행 시간 보조 이온 질량 분 광 법은 공기에 노출 된 시 편과 비교 하 여 염 용액에 노출 된 후 알루미늄 합금의 금속 페인트 계면에서 화학적 매핑 및 부식 형태를 입증 하기 위해 적용 됩니다.

비행 시간 보조 이온 질량 분석기를 사용 하 여 금속 페인트 인터페이스의 이미징 부식

학습하세요 이온 트랩 질량분석법과 다단계 단편화 분석을 활용한 티베트 의학 화합물 구조 분석 방법입니다. Abelmoschus manihot 종자에서 정확한 화합물 식별이 가능하며 천연 의약품 품질 관리에 활용됩니다.

이온 트랩 질량분석법 및 다단계 단편화 분석을 사용한 티베트 의학의 화합물 구조 표준화

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