Name: APA(Active Place Avoidance) 테스트는 생쥐를 위한 효과적이고 다재다능하며 반복 가능한 공간 학습 과제입니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 학습하세요 생쥐의 해마 의존적 공간 학습을 평가하는 APA 테스트 방법을. 노화와 운동 개입이 인지 결과에 미치는 영향을 반복 측정으로 분석할 수 있는 신경과학 행동 실험 기법입니다.

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우리는 이 원고에 설명된 장치의 개발 및 유지 관리에 대해 Queensland Brain Institute(QBI) Animal Behaviour Facility에 감사드립니다.

모든 동물 시술은 호주 국립 보건 의료 연구 위원회(National Health and Medical Research Council of Australia)의 지침에 따라 퀸즐랜드 대학교 동물 윤리 위원회(University of Queensland Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다(승인 번호: QBI/189/15).
1. APA 룸 설정
알림: APA 장치는 32cm 높이의 투명한 원형 경계로 둘러싸인 금속 격자 바닥이 있는 고가 경기장으로 구성됩니다. 금속 막대는 균일한 간격(0.5cm 간격)이며 지름은 0.3cm입니다.
<ol><li>APA 장치가 천장에 장착된 카메라 프레임 내에 있는지 확인하십시오. 시중에서 판매되는 동물 추적 소프트웨어를 사용하여 마우스를 추적합니다.</li>
	<li>APA 경기장은 일반적으로 1rpm 속도로 회전하며 회전 경기장 내에 미리 지정된 60° 고정 충격 구역이 설정됩니다. 마우스가 충격 영역에 들어가면 0.5mA(60Hz, 500ms)의 가벼운 발 충격을 가합니다.</li>
	<li>테스트 중에 충격 영역의 위치가 일정하게 유지되고 실험 설정 내에서 전자적으로 설정되는지 확인합니다. 회전 경기장은 마우스가 그것을 피하기 위해 적극적으로 움직이지 않는 한 마우스를 충격 영역으로 운반합니다.</li>
	<li>회전 플랫폼과 같은 높이(일반적으로 경기장에서 30-50cm 떨어진 4개의 다른 방 벽)에 4개의 새로운 시각적 신호를 배치합니다. 단서가 흑백 기호 또는 A3 용지에 인쇄되고 쉽게 청소할 수 있도록 라미네이트된 모양과 같은 중립색인지 확인합니다(그림 1A).</li>
	<li>방의 빛의 강도가 30-70Lux 사이인지 확인하십시오. 빛의 강도를 높이면 불안과 같은 행동이 유발되고 탐색이 감소합니다.</li>
	<li>시작하기 전에 트래커 프로그램을 열고 APA 작업을 선택합니다.</li>
	<li>Tracker 2D에 대한 옵션에서 실험 탭을 선택합니다. 여기에서 Place Avoidance- One Frame- Position Only 가 선택되어 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 필요한 매개 변수를 구성할 수 있습니다. 구성 파일을 저장하고 필요에 따라 조정합니다.</li>
	<li>실험 탭의 실험 시간 상자에 실험 기간을 설정합니다. 일반적인 실험 시간은 600초 또는 10분입니다.</li>
	<li>타이머 사용이 선택되어 있는지 확인합니다. 위에서 설명한 대로 타이머 영역에서 충격 매개변수를 변경합니다.</li>
	<li>실험(Experiment) 탭의 룸 프레임(Room Frame) 영역에 제공된 공간에 공통 실험 세부 정보를 입력합니다. 예를 들어, 기본 출력 파일 이름이 날짜, 간단한 실험 식별자 및 테스트 날짜로 채워져 있는지 확인합니다. 실험 중에 고유한 마우스 ID를 추가할 수 있도록 밑줄 "_"로 이름을 완성합니다.</li>
	<li>Room Frame(룸 프레임) 영역에는 Targets(대상) 탭도 있습니다. Edit(편집) 버튼을 클릭하여 전체 경기장이 관심 영역에 포함되도록 할 수 있는 기능을 제공합니다. 그런 다음 Arc를 선택하여 충격 대상 영역의 크기와 위치에 대한 조정 가능한 매개변수를 제공합니다(그림 1B).</li>
	<li>추적 탭을 열어 성공적인 마우스 추적을 위해 매개변수를 조정합니다. 콘트라스트 박스에는 어둡게(예: C57Bl/6) 또는 밝은(예: BALB/c) 마우스를 모두 사용할 수 있는 어둡거나 밝은 옵션이 있습니다. 이것은 배경과 쥐 사이에 효과적인 대비를 만듭니다. 알비노 생쥐 균주를 사용할 때는 이러한 대비를 얻을 수 있도록 경기장 아래에 검은색 플라스틱 조각을 놓습니다(그림 2).</li>
	<li>이 지역의 마우스 크기 및 영역 범위를 설정합니다. 경기장에 있을 때 마우스를 효과적으로 인식할 수 있도록 이 매개변수를 설정합니다. 또는 From Calibrator 버튼을 누른 후 설정합니다.</li>
	<li>From Calibrator(캘리브레이터에서) 버튼을 선택하여 경기장이 완전히 관심 영역 마스크에 있는지 확인합니다.<ol><li>이 탭에서 아레나를 시작하여 아레나가 회전할 때 아레나가 마스크에 남아 있는지 확인합니다. 이 탭은 적절한 대비 임계값을 선택하는 데도 중요합니다. 임계값 창에서 빨간색 선을 이동하여 대비 임계값을 조정합니다. 참고: 그림 3A 는 주황색 단색 영역과 마우스가 있는 파란색 "X"로 표시된 최적의 임계값 선택을 보여줍니다. 불량한 임계값은 그림 3B 에 나와 있으며 얼룩덜룩한 주황색만 표시되고 "X"는 표시되지 않습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>장치 탭을 사용하고 속도 버튼을 사용하여 경기장의 회전 방향과 속도를 설정합니다. 양수 및 음수 속도를 모두 선택하여 시계 방향 및 시계 반대 방향 회전을 나타냅니다. Current Source 섹션에서 충격 강도를 설정합니다. 마우스의 가장 일반적인 설정은 1rpm 회전과 0.5mA 충격입니다.</li>
	<li>Current Source 탭에서 충격을 전달하는 방법 또는 시기를 변경합니다.<ol><li>현재 모드가 종속 항목 추적으로 선택되어 있는지 확인합니다. 이렇게 하면 마우스가 충격 영역으로 이동할 때 감전됩니다.</li>
		<li>사용자가 설정한 시간 간격으로 충격을 주려면 시간을 선택합니다. 이전에 녹음된 트랙을 사용하여 파일에서를 선택하여 마우스에 충격을 줍니다. 이는 공간 학습과 무관하게 동일한 기간과 강도로 동일한 수의 충격을 받는 멍에를 씌운 대조군을 제공하기 위함이다. 참고: File Output 및 Window 탭을 사용하면 데이터 및 비디오 파일을 특정 디렉토리에 저장할 수 있습니다. File Output 탭 내의 From Image 버튼을 사용하면 관심 영역이 전체 경기장을 캡처할 수도 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>커튼 뒤로 물러나 재판을 시작하십시오. 실험자가 경기장에 가까이 있고 불필요한 소음이 있으면 동물의 경기력에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	<li>시험 중에 소음과 냄새가 제한되어 마우스에 또 다른 신호를 제공하여 성능에 영향을 줄 수 있는지 확인하십시오. 이를 최소화하기 위한 예로는 임상 쓰레기통을 닫고, 시끄러운 실험실 공간에서 제거된 공간을 사용하고, 생쥐 사이의 장비를 철저히 청소하는 것이 있습니다. 연구원들은 관련 없는 외부 소음을 마스킹하기 위해 백색 잡음 생성기를 사용하는 것을 고려할 수 있습니다.</li>
	<li>집 케이지 침구는 새로운 자극을 제공하고 행동에 영향을 미칠 수 있으므로 행동 테스트 기간 동안 동일하게 유지하십시오.</li>
	<li>일주일에 한 번씩 변동하는 것을 피하려면 매일 일정한 시간에 검사를 실시하십시오.</li>
</ol>2. 실험자 취급에 대한 습관화
<ol><li>테스트 전 최소 2-3일 동안 30초에서 1분 동안 매일 각 마우스를 다루십시오. 동물을 다루면 테스트 중 스트레스와 불안 관련 행동이 크게 줄어듭니다.</li>
	<li>동일한 실험실 가운을 사용하고 습관화 및 테스트 중에는 강한 데오도란트, 코롱 또는 향수를 착용하지 마십시오.</li>
</ol>3. APA 아레나 적응 (1일)
<ol><li>습관화를 위해 대기실이나 검사실로 마우스를 가져옵니다. 최소 30분 동안 마우스가 습관화되도록 두십시오. 생쥐가 익숙해지기 전에 대기실이나 검사실에서 빛의 강도를 설정하십시오.</li>
	<li>트래커 소프트웨어를 설정합니다.<ol><li>실험별 폴더를 만듭니다. 실험 패러다임에 따라 각 날짜 또는 시험에 대해 별도의 폴더가 있습니다. 위에서 설명한 대로 실험 구성을 설정하고 나중에 사용할 수 있도록 이러한 구성을 저장합니다.</li>
		<li>평가판을 시작하기 전에 파일 탭을 클릭하여 저장된 구성을 연 다음 저장 기호를 클릭하고 새로 열린 창에 고유한 마우스 ID를 추가한 다음 재생 탭을 눌러 평가판을 실행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>충격을 가하지 않고 5분 동안 회전하는 경기장에 마우스를 노출시켜 APA 장치에 마우스를 익숙히십시오.</li>
	<li>꼬리 바닥에서 마우스를 들어 올려 장갑을 낀 손에 부드럽게 올려 홈 케이지에서 마우스를 제거합니다. 마우스를 APA 장치로 운반하고 벽을 향하도록 충격 영역에서 멀리 두십시오.</li>
	<li>커튼 뒤로 물러나 재판을 시작하십시오.</li>
	<li>테스트가 끝나면 마우스를 제거하고 홈 케이지로 돌아갑니다.</li>
	<li>모든 소변과 스캣을 수집하고 80%(v/v) 에탄올로 그리드를 철저히 청소합니다.</li>
	<li>모든 마우스에 대해 3.4-3.7단계를 반복합니다.</li>
</ol>4. APA를 활용한 습득 교육 (1-6일)
<ol><li>실내 조명을 습관이 있는 날과 동일한 조건으로 설정하십시오.</li>
	<li>마우스를 대기실이나 검사실로 가져와 최소 30분 동안 습관화시키십시오.</li>
	<li>위에서 설명한 대로 트래커 소프트웨어를 설정합니다.</li>
	<li>평가판 기간을 설정합니다.</li>
	<li>전류 소스가 켜져 있고 설정되어 있는지 확인합니다(예: 0.5mA).</li>
	<li>쇼크 존에서 멀리 떨어진 벽을 향하도록 경기장에 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>커튼 뒤로 물러나 플레이 버튼을 눌러 시험을 시작하십시오. 컴퓨터 화면에서 마우스를 모니터링하고 필요한 경우 개입합니다. 예를 들어, 마우스는 과도한 점프나 발성으로 입증되는 것처럼 충격을 받지 않거나 과도한 스트레스를 받은 것처럼 보입니다.</li>
	<li>테스트가 끝나면 마우스를 제거하고 홈 케이지로 돌아갑니다. 알림: 마우스가 충격을 받고 반응하는지 확인하십시오. 쥐는 뒤로 물러서서 목소리를 냄으로써 충격에 반응합니다. 그렇지 않은 경우 충격을 받지 않을 수 있습니다. 이는 그리드의 스캣 또는 부적절한 추적 때문일 수 있습니다. 따라서 위에서 논의한 대로 각 시도 후에 그리드를 청소하고 마우스 추적을 최적화하는 것이 필수적입니다.</li>
</ol>5. 반전 취득 훈련 (선택, 1-6 일)
<ol><li>반전 작업에서 충격 영역을 일반적으로 이전 위치에서 180°인 새 위치로 재배치합니다. 새로운 충격 구역 위치를 유연하게 학습할 수 있는 마우스의 능력을 평가합니다. 방 신호는 일반적으로 반전 학습 중에 변경되지 않습니다.</li>
	<li>모든 마우스에 대해 3.4-3.7단계를 반복합니다.</li>
</ol>6. 프로브 시험(선택 사항, 1일)
<ol><li>프로브 시험에서 첫 번째 진입까지의 시간 및/또는 충격 영역을 피하는 최대 시간을 측정합니다. 참고: 이는 획득 단계 이후의 메모리 통합을 나타냅니다. 잘 훈련된 쥐는 장시간(>60초) 동안 충격 영역에 들어가는 것을 피하여 공간 학습의 증거를 보여줍니다.</li>
	<li>실내 조명 강도를 습득 교육 날짜와 같이 설정합니다.</li>
	<li>시험장이나 대기실에서 30분 동안 마우스를 습관화하십시오.</li>
	<li>트래커 소프트웨어를 설정합니다.</li>
	<li>시험 기간을 이전에 수행한 테스트 기간과 동일한 시간으로 설정합니다(예: 시험 매개변수에 따라 10분 또는 30분).</li>
	<li>이 시험에 대해 충격을 주지 마십시오.</li>
	<li>혐오스러운 충격 영역의 반대쪽에 마우스를 놓고 벽을 향하게 합니다.</li>
	<li>시험을 시작하고 커튼 뒤로 후퇴하십시오.</li>
	<li>마우스가 효율적으로 추적되는지 확인하십시오.</li>
	<li>컴퓨터 화면에서 마우스를 모니터링하고 충격 영역에 들어가면 시험을 중지합니다. 일부 연구자들은 쥐가 계속해서 충격 영역으로 돌아가는지 확인하기 위해 5분 동안 시험을 계속하는 것을 선호합니다.</li>
	<li>쥐를 부드럽게 집어 들고 집 케이지로 돌아갑니다.</li>
	<li>모든 소변과 대변을 채취하고 그리드를 80%(v/v) 에탄올로 철저히 청소합니다.</li>
</ol>7. 추적 분석
알림: 작업 성능은 다양한 추적 소프트웨어를 통해 달성할 수 있습니다. 다음은 포함된 소프트웨어를 사용하여 APA 작업 중 성능을 결정하는 방법입니다. 이 경우 데이터는 추적 분석 프로그램을 사용하여 분석됩니다.
<ol><li>데이터를 분석하려면 추적 분석 프로그램을 열고 기본 창의 드롭다운 메뉴에서 회피 를 선택합니다.</li>
	<li>Add Task(작업 추가)를 클릭하여 획득 단계에서 저장된 데이터 파일을 새 창에 업로드합니다. Group Name(그룹 이름)에서 분석할 그룹(예: Day 1 또는 time of analysis)을 만듭니다.</li>
	<li>Output Directory(출력 디렉토리)를 클릭하여 분석된 데이터를 저장할 위치를 선택합니다.</li>
	<li>파일 추가 탭을 클릭하고 로컬 드라이브에서 파일을 선택하여 분석할 파일을 추가합니다.</li>
	<li>시간 설정 탭을 클릭하여 분석할 시간을 설정합니다. 이는 분석할 기간(예: 0에서 600초)을 정의할 수 있는 기능을 제공합니다. 또는 빈(60초)의 데이터를 분석합니다.</li>
	<li>모든 추적이 추가되면 해석 탭을 클릭하고 해석 실행 을 선택하여 데이터를 분석합니다. 분석을 통해 여러 폴더가 생성됩니다. 분석할 데이터는 TBLfiles 폴더에 있습니다. 스프레드시트에서 이러한 데이터 파일을 열고 추가 분석(예: 쌍별 비교 또는 반복 측정 ANOVA)에 사용합니다. 참고: 이 분석은 테스트 중 마우스에 대한 단일 페이지 설명이 있는 PS 파일을 포함한 다른 폴더도 생성하며, 추적 맵과 충격이 받은 위치를 보여줍니다.</li>
</ol>

Active Place Avoidance Test를 사용한 생쥐의 공간 학습 이해

<ol><li>Cimadevilla, J. M., Fenton, A. A., Bures, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inactivation+of+dorsal+hippocampus+impairs+active+place+avoidance+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats.</a> Neurosci Lett. 285 (1), 53-56 (2000).</li>
<li>Willis, E. F., Bartlett, P. F., Vukovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+short-+and+longer-term+spatial+learning+and+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protocol for short- and longer-term spatial learning and memory in mice.</a> Front Behav Neurosci. 11, 197(2017).</li>
<li>Blackmore, D. G., Brici, D., Walker, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+three+alternative+paradigms+to+test+spatial+learning+and+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for three alternative paradigms to test spatial learning and memory in mice.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101500(2022).</li>
<li>Pastalkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+of+spatial+information+by+the+maintenance+mechanism+of+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Storage of spatial information by the maintenance mechanism of LTP.</a> Science. 313 (5790), 1141-1144 (2006).</li>
<li>Stuchlik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+avoidance+tasks+as+tools+in+the+behavioral+neuroscience+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Place avoidance tasks as tools in the behavioral neuroscience of learning and memory.</a> Physiol Res. 62 (Suppl 1), S1-S19 (2013).</li>
<li>Vukovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+doublecortin-positive+hippocampal+neurons+are+important+for+learning+but+not+for+remembering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immature doublecortin-positive hippocampal neurons are important for learning but not for remembering.</a> J Neurosci. 33 (15), 6603-6613 (2013).</li>
<li>Blackmore, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exercise+%26%2334%3Bsweet+spot%26%2334%3B+reverses+cognitive+deficits+of+aging+by+growth-hormone-induced+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">An exercise &#34;sweet spot&#34; reverses cognitive deficits of aging by growth-hormone-induced neurogenesis.</a> iScience. 24 (11), 103275(2021).</li>
<li>Codd, L. N., Blackmore, D. G., Vukovic, J., Bartlett, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+reverses+learning+deficits+induced+by+hippocampal+injury+by+promoting+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Exercise reverses learning deficits induced by hippocampal injury by promoting neurogenesis.</a> Sci Rep. 10 (1), 19269(2020).</li>
<li>Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+anxiety+and+stress+responses+in+water+maze+and+Barnes+maze+spatial+memory+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks.</a> Behav Brain Res. 198 (1), 247-251 (2009).</li>
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</ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

결론적으로, 능동적 장소 회피 테스트는 다양한 마우스 균주와 실험 조건에서 사용할 수 있는 효과적인 공간 학습 작업입니다. APA 과제는 MWM과 같은 다른 공간 학습 패러다임(spatial learning paradigm)14과 관련된 한계를 극복하는데, 이는 코르티솔 수치(cortisol levels)9로 측정된 생쥐에게 스트레스를 준다. MWM은 또한 작업10 중에 떠 있는 것으로 보고된 노화된 마우스에는 적합하지 않습니다. 반스 미로(Barnes maze) 및 새로운 물체 위치 테스트와 같은 다른 공간 학습 테스트는 스트레스가 적지만 동일한 마우스 코호트에서 반복 테스트를 수행할 수 있는 빈도에 제한이 있습니다. 따라서 APA 작업의 가장 큰 장점은 참신함을 유지하기 위해 여러 매개변수를 조정할 수 있으므로 여러 번 사용할 수 있다는 것입니다. 실제로, 우리는 해마 절제술의 효과와 운동8의 후속 효과를 조사하기 위해 동일한 생쥐 집단에서 APA 작업을 최대 5번까지 사용했습니다. 각 사례에서 경기장 회전, 충격 영역, 공간 큐를 포함한 매개변수는 테스트 간에 변경되었습니다. 이는 대조군 동물이 높은 횟수의 충격으로 시작하여 각 실험 기간마다 후속 실험일 동안 감소하는 것에서 알 수 있듯이 생쥐가 공간 탐색 단서를 사용하여 과제를 다시 학습하도록 하는 데 효과적이었다8. 일반적으로 5일간의 테스트 패러다임이 끝나면 마지막 날에 10회 이상의 충격을 받았거나 최대 회피 횟수가 60초 미만인 동물은 패러다임을 학습하지 않은 것으로 간주합니다.
APA 작업은 여러 차례의 공간 테스트를 허용하도록 설정을 쉽게 수정할 수 있는 기능 외에도 마우스가 충격 영역을 효과적으로 피하기 위해 공간 탐색을 사용해야 한다는 것을 보장합니다. 예를 들어, 동물은 외부 신호를 사용하여 정지 충격 구역을 찾고 진입을 피해야 한다5. 투기장이 회전함에 따라, 동물들은 탐색을 위해 특이한 접근법을 사용할 수 없으며, 냄새와 같은 외부 수용 단서를 사용할 수 없는데, 이는 이러한 단서들이 투기장과 함께 회전하는 동안 충격 영역과 공간 단서가 정지해 있기 때문이다5.
생쥐가 연구자와 APA 영역에 적절하게 적응하도록 하는 것도 중요합니다. 발 충격의 강도도 최적화해야 하는데, 너무 낮거나 너무 높은 충격 강도는 마우스의 학습 및 작업 수행 능력을 손상시킬 수 있기 때문이다5. 충격 강도는 일반적으로 0.5mA로 설정되며 0.7mA를 초과해서는 안 됩니다. 불안과 같은 행동이 증가한 동물의 경우 빛의 강도와 발 충격 강도를 모두 줄이는 것이 좋습니다. APA 작업 중 불안 증가는 과도한 점프, 경기장 내 통제되지 않은 달리기 또는 장기간의 동결로 나타날 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 0.5mA의 충격 강도를 사용했는데, 이는 이전에 BALB/c에 사용된 것과 동일한 강도로, 불안과 유사한 행동이 더 높은 것으로 알려져 있습니다15.
여기에서는 사용된 활성 장소 회피 장비를 제공한 회사에서 제공한 동물 추적 소프트웨어에 대해 설명합니다. 대체 비디오 추적 소프트웨어도 행동 수행을 분석하는 데 적합합니다. 이러한 프로그램은 또한 APA 작업 중 마우스 성능을 정확하게 측정하고 분석할 수 있습니다. 이러한 프로그램을 사용하면 APA 경기장 내에 여러 구역과 위치를 만들어 행동을 평가할 수 있습니다. APA의 아레나 설정은 하나의 삼각형 쇼크 존으로 구성되며, 입구 수, 처음 입장하는 시간, 쇼크 존에서 보낸 시간이 측정됩니다. 경기장 내에 추가 구역을 추가할 수도 있습니다. 예를 들어, 중앙 구역 또는 충격 구역 반대편에 구역을 추가하여 소요 시간과 해당 구역에서 이동한 거리를 측정할 수 있으며, 이는 혐오 구역을 피하기 위한 동물 전략입니다. 이 프로그램은 마우스의 질량 중심을 추적한 다음 육안 검사를 위해 참조 프레임 위에 저장되고 표시됩니다(그림 6A, B). 마지막으로, 개인 및 그룹 성과에 대한 밀도 히트맵을 생성할 수도 있습니다(그림 6C).
APA 작업을 수행할 때 해결해야 할 잠재적인 문제가 있습니다. 경우에 따라 마우스는 충격 영역에 대한 무반응으로 인해 분석에서 제외해야 합니다. 항상 그렇듯이 제외는 사전 정의된 이상치 조건(예: 평균에서 2 표준 편차를 벗어나는 경우)을 충족하는 경우에만 고려해야 합니다. APA와 같은 복잡한 행동 작업에는 일반적으로 동물의 높은 N 값이 필요합니다. APA를 수행하기 전에 적절한 표본 크기를 계산하기 위해 전력 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 이것은 사용된 균주와 치료 그룹에 따라 다릅니다. 경험에 따르면 각 그룹에 대해 n 값이 10 이상이면 APA 실험을 수행할 때 충분한 전력을 제공하는 것으로 나타났습니다. 이 작업의 주요 문제는 작업 중 마우스의 고품질 추적을 보장하는 것입니다. 작업의 습관화 단계를 사용하여 이러한 작업이 발생하고 있는지 확인해야 합니다. 쥐가 충격에 반응하지 않는 것은 종종 그리드 막대 사이의 스캣 때문입니다. 따라서 모든 동물을 동물이 죽은 후에는 채비를 청소하고 스캣이나 소변을 제거하는 것이 중요합니다. 이것은 또한 따라오는 동물들의 스트레스를 줄일 것입니다. APA 과제는 일반적으로 5일 패러다임을 포함하며, 이는 5일 미만의 효과가 있는 중재와 관련된 연구에 대해 일부 제한 사항을 제시할 수 있습니다. 그러나 단기 기억 또는 공간 학습 습득은 여전히 30분, 단일 세션 접근 방식을 사용하여 이러한 연구에 대해 평가할 수 있습니다.
요약하면, 이 기사에서는 활성 장소 회피 패러다임을 설정하고 사용하여 마우스의 공간 학습을 테스트하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 다양한 색상의 여러 마우스 변형을 테스트할 수 있도록 조건을 변경할 수 있는 기능은 MWM과 같은 다른 전통적인 공간 테스트에 비해 뚜렷한 장점입니다. 또한, 여러 매개변수를 수정하면 반복적인 테스트가 가능하므로 다양한 실험 패러다임 동안 또는 생리학적 노화 중에 공간 학습의 변화를 정확하게 비교할 수 있습니다. 단기간에 APA 테스트는 해마 의존 공간 학습을 위한 정확하고 효과적인 대안으로 입증되었습니다. 앞으로 APA 과제는 야생형 마우스와 형질전환 마우스 모두에서 인지 및 공간 행동에 대한 치료 또는 운동 중재를 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 사용될 수 있습니다.

APA(Active Place Avoidance)는 설치류 1,2,3,4에서 해마 의존 공간 학습을 테스트하는 효과적인 도구입니다. APA 과제 동안, 동물은 회전하는 경기장에 놓여지며 시각 신호를 사용하여 방향을 잡고 혐오스러운 충격 구역5을 피해야 한다. 경기장의 회전은 마우스가 탐색을 위해 특이한 접근 방식을 사용할 수 없도록 하며, 이러한 신호는 충격 영역이 정지 상태로 유지되는 동안 플랫폼에서 회전하기 때문에 냄새 표시를 사용할 수 없습니다5. 경기장의 속도와 방향, 충격 구역 및 시각적 단서의 위치를 변경하면 마우스를 여러 번 다시 테스트할 수 있습니다 6,7,8. APA는 가장 널리 사용되는 공간 학습 테스트 중 하나인 MWM(Morris water maze)에 비해 몇 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 중요한 것은, 생쥐는 수영을 싫어하고 MWM 작업이 극도로 스트레스가 많다는 것이다9. 또한, 늙은 쥐는 MWM 작업(10) 동안 떠다니는 것으로 보고되었으며, 이로 인해 많은 경우에 공간 학습 작업으로 적합하지 않습니다. 또한 MWM 작업에는 테스트 중에 마우스가 찾을 수 있는 숨겨진 수중 플랫폼이 필요합니다. 이로 인해 물이 불투명해야 하며, 이는 일반적으로 흰색 페인트를 첨가하여 달성됩니다. 행동 작업 중 동물을 추적하고 분석하려면 개체와 주변 환경 간의 충분한 대비가 필요하며, Swiss 또는 BALB/c와 같은 특정 마우스 균주는 MWM에서 테스트되지 않아야 합니다. APA 작업에서 이 문제는 그리드 아래에 검은색 플라스틱을 추가하여 우회됩니다.
다중 APA 패러다임은 공간 학습을 테스트하도록 설계되어 효과적인 행동 도구로서의 유용성을 입증했습니다. 예를 들어, 공간 학습의 습득, 유지 및 통합은 일반적으로 3-5일 6,7,11,12일 범위의 동물에 대한 일일 테스트로 수행됩니다. 기억력과 학습은 각 획득일마다 받은 충격의 수를 비교하여 정량화됩니다. 첫 진입까지의 시간과 충격 영역을 피하는 최대 시간도 과제 중 학습 능력의 변화를 결정하는 데 사용할 수 있는 중요한 매개변수입니다. 또는 공간 작업 메모리는 단일 30분 APA 세션 2,13을 수행하여 테스트할 수 있으며, 여기서 공간 학습은 5분 빈에서 충격 수치와 같은 성능을 비교하여 세션 내 변화로 측정됩니다.
이 문서에서는 APA 작업에 대해 설명하고 이 공간 학습 테스트를 수행할 때 고려해야 하는 주요 기능을 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>정전류 소스 CS02</td><td>바이오시그널 그룹</td><td>해당 사항 없음</td><td>Acton, 매사추세츠, 미국</td></tr><tr><td>컨트롤 박스</td><td>바이오시그널 그룹</td><td>해당 사항 없음</td><td>Acton, 매사추세츠, 미국</td></tr><tr><td>에토비전</td><td>놀두스</td><td>버전 16</td><td>Wageningen, 네덜란드</td></tr><tr><td>쇼크 스크램블러</td><td>바이오시그널 그룹</td><td>해당 사항 없음</td><td>Acton, 매사추세츠, 미국</td></tr><tr><td>트랙 분석</td><td>바이오시그널 그룹</td><td>버전 2.2</td><td>Acton, 매사추세츠, 미국</td></tr><tr><td>트래커 프로그램</td><td>바이오시그널 그룹</td><td>버전: 2.36</td><td>Acton, 매사추세츠, 미국</td></tr></tbody></table>

apa(active place avoidance) 테스트는 생쥐를 위한 효과적이고 다재다능하며 반복 가능한 공간 학습 과제입니다.

The Active Place Avoidance (APA) Test, an Effective, Versatile and Repeatable Spatial Learning Task for Mice

설치류의 해마 의존 공간 학습은 다양한 방법을 사용하여 테스트되었습니다. 여기에는 MWM(Morris water maze), Y-maze 및 NOL(Novel Object Location) 작업이 포함됩니다. 최근에는 APA(Active Place Avoidance) 작업이 이러한 전통적인 접근 방식의 대안으로 개발되었습니다. APA 작업에서 마우스는 고정된 충격 영역을 피하기 위해 회전하는 경기장 주변에 배치된 공간 신호를 사용해야 합니다. 조정할 수 있는 여러 매개변수로 인해 APA 작업은 매우 다양한 접근 방식임이 입증되었습니다. 그것은 쥐의 동일한 집단을 위해 세로로 그리고 반복적으로 사용되기에 적합하다. 여기에서는 APA 작업을 성공적으로 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 공간 학습의 다양한 구성 요소를 검사하는 데 사용할 수 있는 대안적인 APA 접근 방식을 강조합니다. 데이터 수집 및 분석 프로세스에 대해 설명합니다. 테스트를 성공적으로 수행할 가능성을 높이기 위해 APA 작업 중 중요한 단계에 대해 설명합니다. APA 작업은 기존의 공간 탐색 테스트에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 노화된 마우스 또는 알츠하이머병과 같은 질병 표현형이 있는 마우스와 함께 사용하는 것이 적절합니다. 작업의 복잡성을 쉽게 변경할 수 있으므로 광범위한 마우스 변형을 테스트할 수 있습니다. 또한, APA 과제는 뇌졸중이나 외상성 뇌 손상과 같은 운동 또는 신경 기능에 영향을 미칠 수 있는 수술 또는 실험적 중재를 받은 동물을 테스트하는 데 적합합니다.

온전한 공간 학습 능력을 가진 마우스는 연속적인 획득 시도 동안 충격 횟수가 감소하는 것을 보여줍니다(그림 4A). 마찬가지로, 충격 영역을 피하는 최대 시간은 마우스가 충격 영역에서 성공적으로 벗어나는 방법을 학습함에 따라 증가합니다(그림 4B). 그러나 효과적인 회피 전략을 학습할 수 없는 마우스는 각 획득 시도에서 일정한 수의 충격을 보여줍니다(그림 4A). 종종, 충격 구역을 식별하지 못하는 마우스는 구역에 들어갈 때마다 여러 번의 충격을 받게 됩니다. 트레이스 맵은 충격 영역을 피하는 방법을 학습하는 마우스(그림 4C)와 충격 영역을 피할 수 없는 마우스(그림 4D)의 예를 제공하는 데 유용합니다. 두 경우 모두 이러한 추적 맵은 획득의 마지막 날을 나타냅니다. 그림 4C의 마우스는 두 개의 원으로 표시된 것처럼 2번의 충격만 받았습니다. 또한 트레이스 맵은 마우스가 빨간색 쐐기로 표시되는 충격 영역의 반대쪽에서 대부분의 시간을 보내는 것을 보여줍니다. 반대로, 그림 4D의 마우스는 더 많은 충격을 받았고, 트레이스 맵은 무질서한 패턴을 보여줍니다. 충격 영역을 피하는 방법을 성공적으로 학습할 수 없는 마우스의 예로는 18개월 된 마우스(그림 4A,B-에서 수정됨)에서 볼 수 있듯이 나이가 많아 해마 신경 발생이 감소한 마우스(Blackmore et al., 20217에서 수정됨), 미성숙뉴런의 화학적 절제 또는 해마 병변(Codd et al., 2020)8.
마우스가 학습하지 못하여 실패한 시험과 장비 설정 실패를 구별하는 것이 중요합니다. 장비 고장으로 인해 결과가 좋지 않은 가장 일반적인 두 가지 원인은 마우스 추적 불량(그림 5A) 또는 마우스에 충격이 가해지지 않는 것입니다. 추적이 잘못되면 마우스가 충격 영역에 있을 때 충격을 받지 않을 수 있습니다. 또는 추적 상태가 좋지 않으면 마우스가 영역에 없을 때 부정확하게 충격을 유발할 수 있습니다. 두 경우 모두 이것은 마우스가 효과적인 회피 전략을 개발하는 데 방해가 됩니다. 추적 불량은 "From Calibrator" 탭에서 임계값을 조정하여 해결할 수 있습니다. 추적 불량은 일반적으로 10분 동안 1,000개 이상의 불량 프레임으로 정의되며 매우 드물게 발생합니다. 잘못된 추적은 탈모증이 발생할 수 있는 늙은 쥐에서 문제가 될 수 있습니다. 충격을 받으면 쥐는 긴장을 풀거나 때때로 목소리를 냄으로써 반응합니다. 마우스는 일반적으로 약간이라도 움직이며 실시간 추적 소프트웨어에서 볼 수 있습니다. 마우스가 충격 영역 내에서 완벽하게 정지하면 명확한 충격 선이 표시됩니다(그림 5B). 이것은 쇼크 박스가 켜져 있지 않거나 막대 사이에 스캣이 끼어 동물에게 전달되는 쇼크의 진폭을 줄이기 때문일 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65935/65935fig01.jpg"> 그림 1: APA 장치, 동작실 및 충격 구역 설정. (A) 테스트 경기장 및 회의실 설정의 예. APA 장치는 높이 올라가 새로운 시각적 단서로 둘러싸인 방 중앙에 배치됩니다. 흑백 시각 신호는 플랫폼과 동일한 높이에서 사용됩니다. (비). 실험 탭의 타겟 기능을 사용하면 전체 경기장을 마스킹하고 충격 영역의 위치를 생성할 수 있습니다. 이 예에서는 빨간색 쐐기로 표시되는 충격 영역이 270°로 생성되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65935/65935fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65935/65935fig02.jpg"> 그림 2: 알비노 마우스 균주에 대한 APA 설정. APA 아레나는 추적 탭에서 라이트 옵션을 선택하고 검은색 아레나 배경을 만들어 BALB/c와 같은 알비노 생쥐 변종에 대해 설정할 수 있습니다. 검은색 배경의 알비노 마우스는 높은 대비를 달성하고 더 나은 마우스 추적 기능을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65935/65935fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65935/65935fig03.jpg"> 그림 3: 마우스 추적에 대한 임계값을 조정하는 것은 필수적입니다. 임상시험 기간 동안 양호한 동물 추적을 보장하기 위해 임계값을 적절하게 조정해야 합니다. 임계값은 From Calibrator 탭의 임계값 창에서 빨간색 선을 이동하여 조정합니다. (A) 개체에 주황색 단색 영역과 파란색 X가 있는 좋은 임계값 선택의 예입니다. (B) 얼룩덜룩한 주황색이 있는 불량한 임계값. 추적이 잘못되면 경기장에서 동물을 잃어버리거나 쥐가 충격 영역에 있을 때 충격을 받는 것을 방지할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65935/65935fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65935/65935fig04.jpg"> 그림 4: 5일 학습 패러다임 및 Trace 맵에서 젊은(10주) 마우스와 노년(18개월) 마우스의 성능 비교. (A) 10주 된 쥐는 5일간의 테스트 동안 18개월 된 쥐에 비해 훨씬 적은 충격을 받았습니다. 실험 첫날에 받은 충격 횟수의 차이는 그룹 간에 미미했지만, 온전한 기억을 가진 어린 쥐는 나이 든 그룹보다 더 빨리 충격 영역에 진입하는 것을 피하는 방법을 배웠습니다. (B) 최대 회피 시간은 10분 시험 동안 충격을 피하는 데 소요된 최대 시간으로 계산되었습니다. 어린 쥐는 나이 든 쥐에 비해 충격 영역에 들어가는 것을 피하는 방법을 빠르게 배웠는데, 이는 어린 쥐가 효과적으로 학습하고 있음을 시사합니다. (C) 이 추적 맵의 마우스는 이 획득 시험에서 두 개의 원으로 표시된 것처럼 두 번의 충격만 받았습니다. 이 마우스는 또한 빨간색 쐐기로 표시되는 충격 지역 맞은편 경기장에서 더 많은 시간을 보냈습니다. (D) 이 쥐는 더 많은 충격을 받았고 충격 영역 근처에서 더 많은 시간을 보냈으며, 이는 이 쥐에서 공간 학습이 달성되지 않았음을 시사합니다. Bonferroni 사후 검정을 사용한 양방향 반복 측정 ANOVA를 사용하여 유의성을 테스트했습니다. 피&lt;0.0001. 패널 A와 B는 Blackmore et al.7에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65935/65935fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65935/65935fig05.jpg"> 그림 5: 추적 맵은 각 시험 동안 각 마우스에 대한 중요한 정보를 제공합니다. (A) 이 추적 예에 있는 직선에 유의하십시오. 이는 추적 소프트웨어가 작업 중에 마우스를 잘못 식별하기 때문입니다. (B) 시험 중 양호한 추적의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65935/65935fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65935/65935fig06.jpg"> 그림 6: 다양한 동물 추적 프로그램에서 시각화 및 히트맵을 추적합니다. (A) 프로그램 1과 (B) 프로그램 2는 모두 동물의 위치와 움직임을 감지하여 동물이 과제나 실험적 처리의 효과를 학습하는지 육안으로 검사할 수 있는 추적 플롯을 생성합니다. 두 프로그램 모두 작업을 효율적으로 학습한 동물의 동일한 트랙 플롯을 보여줍니다. (씨) 핫스팟을 식별하고 데이터 포인트를 클러스터링하는 데 도움이 되는 히트맵도 생성할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65935/65935fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서 우리는 설치류를 위해 설계된 해마 의존 공간 학습 패러다임인 활성 장소 회피 테스트를 위한 프로토콜을 제시합니다. 주요 매개변수를 변경하면 처리 전후 또는 시간이 지남에 따라 동물을 다시 테스트할 수 있습니다.

APA(Active Place Avoidance) 테스트는 생쥐를 위한 효과적이고 다재다능하며 반복 가능한 공간 학습 과제입니다.

Hippocampus-dependent spatial learning in rodents has been tested using a variety of methods. These include the Morris water maze (MWM), Y-maze, and novel ...

우리는 해마 의존적 공간 학습이 노화에 따라 어떻게 변화하는지 조사하고자 합니다. 그런 다음 신체 운동과 같은 중재가 이러한 인지 결과를 어떻게 변화시키는지 조사합니다. 이 행동 패러다임을 통해 우리는 동일한 생쥐 집단에서 이러한 것들을 쉽게 조사할 수 있습니다.생쥐의 공간 학습을 테스트하기 위해 여러 인지 테스트를 사용할 수 있으며, 대부분은 수십 년 동안 확립되었습니다. 여기에는 Morris 물 미로, Y-미로 및 Barnes 미로가 포함됩니다. 이들 각각은 특히 종단 테스트와 관련하여 제한 사항이 있습니다.주요 실험적 과제는 종단 방식으로 동물을 테스트하는 것이므로 운동 중재의 효과를 정확하게 결정하기 어렵습니다. 대부분의 공간 학습 테스트는 쉽게 배울 수 있거나 스트레스가 많거나 질병 모델에 적합하지 않습니다. 경기장의 회전 방향 또는 충격 구역의 위치와 같은 활성 장소 회피의 일부 주요 구성 요소를 변경함으로써 이 테스트는 여러 번 사용할 수 있습니다.경기장 바닥의 색상을 변경하여 C57-black-6 또는 스위스 마우스와 같은 다양한 색상의 마우스를 테스트할 수 있습니다.

the-active-place-avoidance-apa-test-an-effective-versatile-repeatable

Research

JoVE Journal

Behavior

이 프로토콜의 목표는 설치류의 공간 인지를 조사하는 것입니다. double-H water maze는 새로운 테스트로, 학습, 통합 및 기억의 다양한 구성 요소와 기억 시스템의 상호 작용을 설명하는 데 특히 유용합니다.

더블 H 미로 : 설치류의 강력한 행동 학습에 대한 테스트 및 메모리

이 프로토콜 분석 결과 행동, 반 즈 미로 테스트에 따라, 어떻게 본능적 인 방어 연구 작업 공간 환경 지식에 의해 수정 됩니다.

생쥐의 본능적 인 방어 하는 동안 공간 메모리의 역할을 조사에 대 한 행동 분석 결과

이 프로토콜은 공간 학습 및 반 즈 미로 사용 하 여 메모리를 측정 합니다. 새로운 계 집 아이-에서-조 난 패러다임 쥐에서 prosocial 동작과 운동 활동을 평가 하는 데 사용 됩니다.

공간 학습 및 반 즈 미로 계 집 아이-에서-조 난 패러다임을 사용 하 여 마우스 Prosocial 동작 분석

이 논문 조작 조화 자동 높은 처리량의 행동 모니터링 시스템 IntelliCage 시스템을 사용 하 여 Alzheimer의 질병의 유전자 모델 인지 평가 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

자동화, Alzheimer의 질병, IntelliCage를 사용 하 여 여러 유전자 모델에서 인지 기능에 대 한 장기적인 행동 분석 결과

여기 우리 디자인, 비용, 및 건설의 필수 장비를 포함 하 여 murine 개체 위치 및 소설 개체 인식 행동 테스트, 경제적인 설립에 대 한 포괄적인 지침을 포함 하는 프로토콜을 제공 뿐만 아니라 행동 테스트, 데이터 수집 및 분석의 실행.

소설 개체 인식 및 행동 예산에 쥐에 테스트 개체 위치

현재 프로토콜은 설치류의 공간 탐색 및 행동 표현형을 테스트하기 위한 고유한 시스템인 재구성 가능한 미로를 설명합니다. 이 미로 시스템의 적응성은 단일 물리적 환경에서 다양한 실험을 실행할 수 있습니다. 구조적 재배열의 용이성은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 생성합니다.

재구성 가능한 미로 시스템을 활용하여 설치류에서 공간 탐색 테스트의 재현성 향상

설치류에 대한 대부분의 행동 실험은 원래 쥐를 위해 고안되었습니다. 쥐와 생쥐의 행동 차이로 인해 때때로 생쥐에 대한 수정이 필요합니다. 우리는 생쥐의 공간 작업 기억을 테스트하여 작업 기억 작업 중 스트레스를 최소화하는 방법을 제시합니다.

반자동 8팔 방사형 미로에서 마우스를 위한 식욕을 유발하는 공간 작업 기억 작업, 미로에서 두려운 기억 연관성 감소

3-4개월 된 유아가 발견을 통해 과제를 배우고 다리 움직임을 캡처하여 학습 과정을 정량화하는 방법을 설명합니다.

젊은 유아의 학습을 정량화 : 추적 다리 동작을 발견 학습 작업 중

생쥐의 환경 강화는 복잡하고 도전적인 설정뿐만 아니라 생쥐의 강력한 대사 및 항암 효과를 보장하기 위한 포괄적인 사육 및 취급 기술을 필요로 합니다. 이 프로토콜은 마우스에서 위에서 언급한 효과를 재현하기 위한 자세한 절차를 제공합니다.

풍부한 환경에서의 주택 마우스를위한 프로토콜

이 프로토콜은 연구자들이 조건화된 장소 선호 및 운동 행동 민감성 분석을 사용하여 중독의 이러한 측면을 테스트하기 위해 고안된 실험을 수행할 수 있도록 하기 위한 것입니다.

코카인 유발 행동 과민성 및 마우스의 조건 장소 선호도 평가

학습하세요 생쥐의 해마 의존적 공간 학습을 평가하는 APA 테스트 방법을. 노화와 운동 개입이 인지 결과에 미치는 영향을 반복 측정으로 분석할 수 있는 신경과학 행동 실험 기법입니다.

APA(Active Place Avoidance) 테스트는 생쥐를 위한 효과적이고 다재다능하며 반복 가능한 공간 학습 과제입니다.

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