Name: 중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 사이의 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전달 in vitro (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 배우세요 중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 세포 간 터널링 나노튜브를 통한 양방향 미토콘드리아 전달 메커니즘을 in vitro에서 연구하는 방법을. 이 기법은 손상된 망막 세포 구조를 회복하는 데 활용됩니다.

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<meta charset="utf8"></head><body>MSC와 ARPE19 공배양에서의 미토콘드리아 전달 조사

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<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Solarbio</td><td>P1110</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>NEST</td><td>703001</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>NEST</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>ARPE19 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-2302</td><td>세포주</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Beyotime</td><td>ST025</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace 바이올렛</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬라이드</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F-12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>VivaCell</td><td>C04002-500</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave 시약</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>MSCs</td><td>Nuwacell</td><td>RC02003</td><td>세포주</td></tr><tr><td>ncMission</td><td>Shownin</td><td>RP02010</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pCT-Mito-GFP</td><td>SBI</td><td>CYTO102-PA-1</td><td>플라스 미드; 에서&nbsp; https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>MCE</td><td>HY-B1743A</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Axygen</td><td>TF-1000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 플레이트</td><td>Corning</td><td>3470</td><td></td></tr></tbody></table>

중간엽 줄기 세포와 망막 색소 상피 사이의 터널링 나노튜브를 통한 미토콘드리아 전달 in vitro

Mitochondrial Transfer Via Tunneling Nanotubes Between Mesenchymal Stem Cells and Retinal Pigment Epithelium In Vitro

중간엽 줄기 세포(MSC)와 ARPE19 세포의 직접적인 공동 배양을 보여주는 개략도는 그림 1에 나와 있습니다. mito-GFP를 공여세포로 발현하도록 조작된 MSCs와 수혈세포로서 보라색 표지된 세포질막을 가진 ARPE19-mito-RFP 세포를 1:1의 비율로 공동 배양했습니다. 24시간의 공동 배양 기간 후, 세포를 팔로이딘에 대해 염색하고 공초점 현미경을 사용하여 검사했습니다. 생성된 세포 집단에는 MSC-mito-GFP 세포, ARPE19-mito-RFP 세포, mito-GFP를 포함하는 ARPE19-mito-RFP 세포 및 mito-RFP를 포함하는 MSC-mito-GFP 세포가 포함되었습니다. 특히, ARPE19 세포에서 mito-GFP의 존재와 MSC에서 mito-RFP의 존재는 미토콘드리아 양방향 전달을 시사했습니다.
TNT 형성에 대한 구체적인 내용은 그림 2에 나와 있습니다. 이러한 구조는 동일한 유형의 세포(그림 2A-C)뿐만 아니라 다른 유형의 세포 간(그림 2D)에도 세포 간 연결을 설정할 수 있습니다. 터널링 나노튜브(TNT)는 인접 세포를 연결하는 도관 역할을 하며, 세포질 연속성과 미토콘드리아의 이동을 용이하게 하는 개방형 끝단을 가진 독특한 F-액틴이 풍부한 막 구조를 나타냅니다. Z축 이미징을 활용하면 TNT가 세포외 기질에 단단히 고정되어 있지 않고 오히려 배양 배지 내에 부유하여 기존 세포 돌출부와 구별된다는 것이 분명합니다. 미토콘드리아 전달은 그림 3에서 분명하게 나타나며, 보라색 양성 ARPE19 세포는 MSC에서 유래한 미토콘드리아를 나타내는 분산된 녹색 점선 형광을 나타냅니다(그림 3A). 적색 점선 형광을 포함하는 보라색 음성 MSC는 ARPE19 세포의 미토콘드리아 전달을 나타냅니다(그림 3B). 그림 4는 초고해상도 이미징에서 TNT 형성 및 미토콘드리아 전달을 보여주며, 이를 통해 TNT를 통한 미토콘드리아 전달에 대한 자세한 내용을 볼 수 있습니다. 비디오 1은 TNT를 통한 미토콘드리아 수송의 역학을 보여줍니다.
미토콘드리아 전달의 전제 조건이 미토콘드리아 분비 및 흡수가 아니라 TNT와 같은 신체 접촉임을 추가로 입증하기 위해 이전에 보고된 공동 배양 방법10을 사용했습니다. 그림 5A에서 볼 수 있듯이, MSC 및 ARPE19 세포는 각각 트랜스웰 플레이트의 상부 및 하부 챔버에 파종되었습니다. 이들은 0.4μm 기공이 있는 필터로 분리했는데, 이 필터는 MSC와 ARPE19 세포 사이의 직접 접촉을 차단했지만 미토콘드리아의 통과는 허용했습니다. 24시간의 공동 배양 후, 하부 챔버의 ARPE19 세포를 분석하고 상부 챔버의 MSC에서 약간의 mito-GFP를 관찰했습니다(그림 5B). 이러한 결과는 미토콘드리아 전달이 MSC와 ARPE19 세포 간의 직접적인 접촉을 필요로 한다는 것을 시사합니다.
최종적으로 TNT 형성 및 미토콘드리아 전달의 정량화가 수행되었으며 해당 결과는 그림 6에 나와 있습니다. MSC는 ARPE19 세포보다 미토콘드리아를 공여하는 능력이 훨씬 더 높았습니다(p=0.0286). 이러한 결과는 MSC가 미토콘드리아를 망막 색소 상피 세포로 전달할 수 있는 능력을 가지고 있음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig01.jpg"> 그림 1: MSC와 ARPE19 세포의 공동 배양에 대한 개략도. CellTrace Violet으로 표지된 mito-GFP 및 ARPE19-mito-RFP 세포를 발현하는 MSC는 1:1의 비율로 24시간 동안 공동 배양됩니다. 바이올렛+ 세포의 Mito-GFP는 MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아의 전달을 표시하고, 바이올 렛 세포의 Mito-RFP는 ARPE19 세포에서 MSC로의 미토콘드리아의 전달을 표시합니다. 약어: GFP = 녹색 형광 단백질; RFP = 적색 형광 단백질; MSCs = 중간엽 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig02.jpg"> 그림 2: MSC와 ARPE19 세포 사이의 TNT 형성. 흰색 화살촉은 TNT 형성을 나타내고, 녹색 화살촉은 mito-GFP가 있는 미토콘드리아를 나타내고, 빨간색 화살촉은 mito-RFP가 있는 미토콘드리아를 나타냅니다. (ᅡ,ᄂ) ARPE19 세포 사이의 TNT 형성. (C) MSC 사이의 TNT 형성 (D) MSC와 ARPE19 세포 사이의 TNT 형성. 배양 배지에 현탁된 TNT를 보여주는 Z축 이미징. 스케일 바 = 25 μm. 약어: MSCs = 중간엽 줄기 세포; TNT = 터널링 나노튜브. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig03.jpg"> 그림 3: MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아 전달. (A) 흰색 점선 원은 MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아(mito-GFP) 전달을 나타내고, (B) 노란색 점선 원은 ARPE19 세포에서 MSC로의 미토콘드리아(mito-RFP) 전달을 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어 : GFP = 녹색 형광 단백질; RFP = 적색 형광 단백질; MSCs = 중간엽 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig04.jpg"> 그림 4: 초고해상도 현미경을 이용한 MSC와 ARPE19 세포 간의 TNT 형성 및 미토콘드리아 전달. (A 및 B) MSC에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아 수송. (C) 초고해상도 이미징에서 TNT의 세부 정보. (D) 초고해상도 이미징에서 ARPE19 세포에 존재하는 MSC의 녹색 미토콘드리아. 눈금 막대 = 5 μm. 약어: MSCs = 중간엽 줄기 세포; TNT = 터널링 나노튜브. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig05.jpg"> 그림 5: MSC 및 ARPE19 세포의 트랜스웰 시스템에서 간접 공동 배양에서 거의 검출할 수 없는 미토콘드리아 전달. (A) 트랜스웰 시스템에서 MSC와 ARPE19 세포의 공동 배양에 대한 개략도. (B) MSC와 24시간 동안 간접 공동 배양 후 트랜스웰 플레이트 하단에 있는 ARPE19 세포의 대표 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66917/66917fig06.jpg"> 그림 6: TNT 형성 및 미토콘드리아 전달의 정량화. (A) TNT 형성, (B) 미토콘드리아 전달. 약어: M = MSCs = 중간엽 줄기 세포; A = ARPE19 세포; TNTs = 터널링 나노튜브; MA = MSC와 ARPE19 세포 사이의 TNT 형성; M-M = MSC 사이의 TNT 형성; A-A = ARPE19 세포 사이의 TNT 형성. n = 4, 평균 ± SD, Mann-Whitney U-검정, *p &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 S1: 플라스미드 pCT-Mito-copGFP의 매핑. Mito-GFP(CYTO102-PA-1)를 구입했습니다. Mitochondria Cyto-Tracer, pCT-Mito-GFP(CMV)는 Cox8 태그를 통해 copGFP와 융합하여 copGFP로 미토콘드리아를 라벨링합니다. 이 copGFP 융합은 CMV 프로모터에 의해 구동되어 HeLa, HEK293 및 HT1080과 같은 세포주에서 강력한 발현을 가능하게 합니다. Mito-RFP는 GFP를 RFP로 대체함으로써 mito-GFP에서 수정되었다; 그것은 Puromycin 저항성 유전자를 가지고 있습니다. 이 플라스미드의 렌티바이러스 패키징은 전문 회사에서 수행합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_Supplementary%20figure.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: MSC와 ARPE19 세포 사이의 TNT 매개 미토콘드리아 수송. TNT는 MSC 및 ARPE19 세포의 양방향 이동을 통해 생성되어 MSC 세포에서 ARPE19 세포로의 미토콘드리아 전달을 촉진합니다. 약어: MSCs = 중간엽 줄기 세포; TNT = 터널링 나노튜브. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66917/66917_TNT_Video.zip" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Mitochondrial transfer is a normal physiological phenomenon that occurs widely among various types of cells. In the study to date, the most important ...

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Research

JoVE Journal

Biology

이 비디오에서는 원심분리를 통해 형광 표지된 미토콘드리아를 교모세포종 줄기세포(GSC)로 전달할 수 있는 방법을 보여줍니다. 공여자 미토콘드리아의 성공적인 흡수 및 기능적 통합은 컨포칼 현미경을 사용하여 형광을 검출함으로써 확인됩니다.

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여기서는 막 및 F-액틴 표지와 z-스택 공초점 영상을 사용하여 인간 표피 각질세포와 진피 섬유아세포 사이의 터널링 나노튜브를 시각화하는 표준화된 프로토콜을 제시하며, 선택적으로 α-튜불린 공동 염색을 통해 조직공학 응용을 위한 재현 가능한 검출과 세포골격 특성 분석을 가능하게 합니다.

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