Name: 만성 뇌 영상에 대한 Craniotomy 외과 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-15T11:06:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 배우세요 쥐에서 유리 덮개 두개골 창 이식을 통한 만성 뇌 영상 기법을. 이 방법은 신피질의 장기간 생체 내 관찰을 가능하게 하여 신경과학 연구에 필수적입니다.

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<ol><li> IACUC 승인 절차를 사용하여 isoflurane와 쥐 (유도 4 %, 수술을 1.5-2 %)을 마취. 꼬리 및 / 또는 발가락 핀치스이 동물이 완전히 진정되도록하기 위해 사용하는 것이 중요합니다. </li><li> 쥐 트리머를 사용하여, 최대 눈 목 뒤쪽에서 머리를 면도. </li><li> 수술 물을 다시 순환 담요 이상 stereotaxic 프레임에 마우스를 놓습니다. 단단히 귀에 바와 함께 머리를 확보. </li><li> 밖으로 건조에서 동물의 눈에을 방지하기 위해, 눈 연고를 적용합니다. </li><li> Dexamethasone (0.2 밀리그램 / 킬로그램)와 Carprofen가 (5 밀리그램 / 킬로그램) 각각의 뇌 및 / 또는 염증 반응의 붓기 방지하기 위해, subcutaneously, 관리할 수 있습니다. </li><li> 수술을 시작하기 전에 70 % 알코올 및 betadine 세 교대 swipes와 함께 피부를 닦는하여 운영 지역을 소독. </li><li> 모든 수술기구는 유리 비드 살균기를 사용하여 사전에 소독하고 있습니다. 에탄올로 소독되었습니다 가위를 사용하여 살다가 두 주동이의 방향으로 상처 거의 눈꺼풀에 도달, 두 경사 상처 뒤에있는 모든 머리의 기본을 따라 수평 절단, 시작, 두개골의 맨 위에 피부를 제거 그것은 정중선에서 수렴. </li><li> lidocaine + 에피네프린 솔루션의 한 방울이 과도한 출혈이나 통증을 피하기 위해 골막에이 시점에서 적용됩니다. 메스로 두개골의 가장자리에 골막을 철회. 또한, 가볍게 목 뒤쪽의 근육을 철회. </li><li> 부드럽게 마른 표면을 만들기 위해 메스로 두개골의 전체 노출 영역을 다쳤어요. 나중에 적용할 때 접착제가 잘 준수 수 있듯이 매우 중요합니다. </li><li> 이미징 사이트가 선택되면, 하나는 두개골 창을 만들 준비가되어 있습니다. 첫째, 부드럽게 공압 치과 드릴 직경 약 4 mm의 원형 &quot;을 그려.&quot; </li><li> 약간 드릴링 후, 두개골 표면에 다시 lidocaine + 에피네프린 솔루션을 적용할 수 있습니다. 뼈의 매우 얇은 층이 남아있는 책임이 중지합니다. 이 방법을 제공하는 방법 느낄 수 craniotomy의 중앙에 부드럽게 밀어 하나는 일반적으로이 단계에 도달 알고 있습니다. </li><li> 뼈 해면 구조 - - 뼈 trabeculae의 생리와 복용의 이점을 한 방울에 따라 매우 얇은 팁 포셉와 두개골에서 craniotomy 멀리 리프트. 그것은 두개골을 들어올려하고 두라의 출혈을 방지하므로 생리가 중요합니다. </li><li> 이전에 두개골이 제거되었을 때 가끔 발생하는 작은 출혈을 멈추게하는 두라 메이터에 호수에 배어있다 Gelfoam을 적용합니다. </li><li> 두라 메이터 표면을 건조되며 출혈이 없다는 것을 확인한 후, 부드럽게 두라 메이터 위에 멸균 5mm 유리 커버 슬립을 믿는다. (참고 : 다른 그룹도 두라 이상 낮은 용융 점 아가로 오스 (1.2 %)의 드롭을 배치하고 한천 위에 coverslip을 넣어.) </li><li> 두개골에 반대 반구에 cyanocrylate 기반 접착제 한 방울을 적용합니다. 조심하는 것이 유리 밑에 넣고되지 동안 바늘의 도움으로, 부드럽게 모든 창 주변의 접착제를 적용합니다. 접착제 이제 두개골의 전체 표면 위에 얇은 레이어에 적용할 수 있습니다. </li><li> 접착제가 건조되면, 그것을 보장하기 위해서, 또한 커버 슬립의 작은 림을 포함, 두개골 표면에 걸쳐 치과 아크릴을 혼합하고 그것을 적용해야합니다. </li><li> 커버 슬립을 확보 후, 치과 아크릴과 창문 주위에 작은 우물을합니다. 또한, 치과 아크릴에 티타늄 막대를 삽입할 수 있습니다. 이 막대는 나중에 영상을위한 현미경의 무대에 안전하게 마우스를 첨부하는 데 사용됩니다. 그것은 두개골 창은 병렬가되도록, 바가 수준 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 막대 아래에 종이를 게재하면 아크릴은 견고하면서 막대가 수준 유지하도록 할 수 있습니다. </li><li> 치과 아크릴은 10 분 (강화) 치료 허용, 어떤 시점에 티타늄 막대 제자리에 고정합니다. 그것이 복구까지 따뜻한 새장에 동물을 배치합니다. </li><li> 마취에서 회복 후, 동물은 당일 몇 군데하실 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)"> In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 85, 161-165 (1997).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404, 876-881 (2000).</li>
<li>Trachtenberg, J. T., Chen, B., Knott, G. W., Feng, G., Sanes, J. R., Welker, E., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., DePaola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3, (2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Wilbrecht, L., Knott, G. W., Welker, E., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+and+cell-type-specific+spine+growth+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent and cell-type-specific spine growth in the neocortex.</a> Nature. 441, 979-983 (2006).</li>
</ol>

우리가 비디오에서 두 광자 현미경의 사용과 결합하여 보조 수치, 두개골 윈도우 준비에 나타난 것처럼, 생체내 네크로 텍스의 구조와 기능에서 공부하는 매우 강력한 도구입니다. 기술 관련 해부학 및 미세 수술 절차 및이 준비가 필요 기술에 익숙해지로 엄격한 훈련이 필요합니다. 단지 깨끗한 수술은 만성 이미징 사용할 수 있습니다. 두라이 과도하거나 구멍을 조작하면, 준비는 이미지에 사용해서는 안됩니다.

티타늄 막대 사용자 정의 - 만든

만성 뇌 영상에 대한 craniotomy 외과 절차

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

이미징 기술이 연구의 뇌 기능에 점차 중요 해지고 있습니다. 그것이 사는 그대로 두뇌의 연구를 수 있기 때문에 그 중에서도 두 광자 레이저 스캐닝 현미경은 매우 유용한 방법으로 떠오르고있다. 적절한 준비와 함께,이 기술은 몇 분 거리 개월, 만성 같은 피질 영역의 관찰하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 두 광자 현미경을 사용하여 두뇌의 생체내 이미징에서 만성위한 준비를 보여줍니다. 이 기술은 처음에는 지금 Janelia 팜에서 하워드 휴즈 의학 연구소의 탐정이다 박사 카렐 스보로 개척되었다. 여기에 표시된 것과 같은 준비가 이미지 대뇌 피질의 혈류 역학에, 칼슘에 민감한 염료를 사용하여, 또는 내장 광학 이미징 연구의 연결 활동을 기록하는 neocortical 구조 (예, 돌기 및 axonal 역학)의 영상에 사용될 수 있습니다. 네크로 텍스의 깊은 영상은 최적의 두개골 창 수술 가능합니다. 수술하는 동안 두라 메이터을 손상하지에 극단주의를 사용하여 함께, 감염을 피하기 위해 가능한 한 가장 멸균 조건 하에서 운영, 성공적이고 지속적인 유리 덮인 두개골 Windows에서 발생합니다.

이 비디오 및 프로토콜은 설치류에 유리 커버 두개골 창을 이식하는 방법을 보여줍니다. 이러한 준비는 생체내 개월 시간 단위 동안 네크로 텍스의 2 광자 이미징에서 만성 사용할 수 있습니다. 그것은 광학 내장 신호 이미징을 포함한 이미징의 다른 유형에도 사용할 수 있습니다.

만성 뇌 영상에 대한 Craniotomy 외과 절차

영상 기술은 뇌 기능 연구에서 점점 더 중요한 비중을 차지하고 있습니다. 그중에서도 이광자 레이저 주사 현미경(two-photon laser scanning microscopy)은 ...

영상 기술은 뇌 기능 연구에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 그중에서도 이광자 레이저 현미경술은 적절한 준비 과정을 통해 살아있는 뇌를 연구할 수 있게 해주어 매우 유용한 방법으로 부상했습니다. 이 기술을 이용하면 동일한 피질 영역을 수 분에서 수개월까지 만성적으로 관찰할 수 있습니다.이 영상에서는 이광자 현미경을 이용한 뇌의 만성 생체 내(in vivo) 이미징 준비 과정을 보여드립니다. 오늘 시연할 두개골 창(cranial window) 준비법은 Janelia Farm의 Howard Hughes Medical Institute 연구원인 Carl Voda 박사가 처음 개척하였습니다. 저는 University of California Los Angeles 신경과 Carlos Porter Cayo 연구실의 Ricardo Must입니다.오늘은 만성 in vivo 이미징을 위한 두개창(cranial window) 제작 절차를 보여드리겠습니다. 이 준비 과정은 이광자 레이저 현미경을 사용하여 뇌 깊은 곳을 이미징할 수 있게 해주므로 매우 유용합니다. 그럼 시작하겠습니다.수술을 시작하기 전, 마우스는 이소플루레인(isoflurane)으로 마취합니다. 유도 시에는 4%, 수술 중에는 1.5~2%를 사용하며, I-A-C-U-C 승인 절차를 따릅니다. 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 또는 발가락 집기(pinch test)를 수행하는 것이 중요합니다. 설치류용 트리머를 사용하여 목 뒤부터 눈까지의 털을 깎아냅니다.제모 후, 마우스를 37°C로 설정된 온수 순환 담요 위에 놓인 정위 고정기(stereotaxic frame)에 배치하고, 이어바(ear bars)를 사용하여 머리를 단단히 고정합니다. 그런 다음 동물의 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. 이어서 dexamethasone 0.2 mg/kg과 carprofen 5 mg/kg을 피하 투여합니다.뇌 부종 및 염증 반응을 각각 방지하기 위함입니다. 수술을 시작하기 전, 70% alcohol과 Betadine을 적신 면봉으로 피부를 세 번 교대로 닦아 수술 부위를 반드시 멸균하십시오. 모든 수술 도구는 에탄올을 분사한 가위와 함께 유리 구슬 멸균기를 사용하여 미리 멸균되었습니다.머리 기저부를 따라 수평으로 절개한 후, 눈꺼풀에 거의 닿을 때까지 주둥이 방향으로 두 차례 절개하여 두개골 상단의 피부를 제거합니다. 그다음 중앙선에서 만나는 두 개의 사선 절개를 실시합니다. 이때 과도한 출혈이나 통증을 방지하기 위해 골막에 리도카인 및 에피네프린 용액 한 방울을 도포하고, 메스를 사용하여 골막을 두개골 가장자리까지 젖힙니다.목 뒷부분의 근육층 또한 가볍게 견인합니다. 그런 다음 노출된 두개골 전 영역을 메스로 부드럽게 긁어 건조한 표면을 만듭니다. 이는 나중에 접착제를 도포할 때 접착력을 높이기 위해 매우 중요한 과정입니다.이미징 부위가 결정되면, 먼저 두개골 창(cranial window)을 생성할 준비를 합니다. 공압식 치과용 드릴을 사용하여 지름 약 4mm의 원을 조심스럽게 그립니다. 가볍게 드릴링한 후, 리도카인 에피네프린 용액을 두개골 표면에 다시 도포합니다.매우 얇은 뼈 층(보통 뼈 한 겹 정도)이 남았을 때 드릴링을 중단합니다. 이 단계는 생리식염수 한 방울을 떨어뜨린 후 두개골 절제술 부위의 중심을 부드럽게 눌러 뼈가 밀려 들어가는 느낌을 확인하고, 뼈의 해면 구조인 뼈trabecula를 활용함으로써 도달할 수 있습니다.매우 얇은 팁 핀셋을 사용하여 두개골 절제 부위를 두개골로부터 들어 올립니다. 식염수는 두개골을 들어 올리는 것을 돕고 경막의 출혈을 방지하는 데 중요합니다. 다음으로, 두개골 제거 시 간혹 발생하는 미세 출혈을 멈추기 위해 미리 식염수에 적셔둔 겔 폼을 경막에 도포합니다.경막 표면을 건조시키고 출혈이 없는지 확인한 후, 5mm의 멸균 유리 커버슬립을 경막 위에 조심스럽게 놓습니다. 시아노아크릴레이트 기반의 접착제 한 방울을 두개골의 반대쪽 뇌반구에 도포합니다. 바늘을 사용하여 유리 아래로 접착제가 들어가지 않도록 주의하며 윈도우 주변을 따라 접착제를 조심스럽게 도포합니다.이제 두개골 전체 표면에 접착제를 얇게 도포할 수 있습니다. 접착제가 마르면 치과용 아크릴을 혼합하여 두개골 표면 전체에 도포하며, 이때 커버 슬립을 고정하기 위해 커버 슬립의 가장자리 일부까지 덮어줍니다. 커버 슬립을 고정한 후, 치과용 아크릴을 사용하여 윈도우 주변에 작은 웰을 만듭니다.티타늄 바 또한 치과용 아크릴에 매립됩니다. 이 바는 나중에 마우스를 현미경 스테이지에 단단히 고정하는 데 사용됩니다. 이미징을 위해서는 바가 두개골 창과 평행하도록 수평을 맞추는 것이 중요합니다.바 아래에 종이 한 장을 배치하면 아크릴이 굳는 동안 바의 수평을 유지할 수 있습니다. 치과용 아크릴을 10분 동안 경화 또는 경화시키면 티타늄 바가 제자리에 고정됩니다. 그런 다음 동물은 회복될 때까지 따뜻한 케이지에 넣습니다. 마취에서 회복된 후, 동물은 당일에 바로 영상 촬영이 가능합니다.이 영상은 3개월 된 GFPM 마우스의 체성감각 피질 위에 설치된 두개창을 통해, 자체 제작한 이광자 현미경으로 5 µm 간격으로 촬영한 160장의 이미지 스택을 보여줍니다. 이 형질전환 마우스 라인은 피라미드 뉴런의 일부 하위 집합에서 GFP를 발현합니다. 5층 및 2-3층의 이미지는 910 nm의 여기 파장과 0.8 개구수(numerical aperture)를 가진 40x 수침 대물렌즈를 사용하여 촬영되었습니다.더 표층의 이미지에서는 파라메탈 세포(parametal cells)의 정단 수지상 돌기(apical dendrites)의 수지상 분지를 쉽게 인식할 수 있습니다. 각 뉴런의 수지상 돌기 정단 묶음은 하나의 큰 정단 수지상 돌기로 수렴합니다. 이 주요 정단 수지상 돌기에서 뻗어 나오는 더 작은 사선 수지상 돌기(oblique dendrites)도 관찰할 수 있으며, 시야를 가로지르는 축삭(axons) 또한 뚜렷하게 보입니다.이것은 동일한 40 x 대물렌즈를 사용하여 더 높은 배율에서 1.5 µm 간격으로 촬영한 12장의 이미지 스택입니다. 표면의 수지상 돌기가 개별 수지상 가시를 식별할 수 있을 만큼 충분히 높은 해상도로 나타나 있습니다. 지금까지 투광자 현미경을 이용한 뇌의 만성적 이미징을 위한 두개창 준비 방법을 보여드렸습니다. 이 방법은 살아있는 뇌의 구조와 기능을 단일 이미징뿐만 아니라 수개월에 걸쳐 여러 차례의 만성적 이미징을 통해 연구할 수 있게 해주므로, 뇌 연구에 있어 매우 강력한 방법입니다.두개창 준비의 또 다른 장점은 넓은 시야를 촬영할 수 있다는 점이며, 이를 통해 전체 뉴런이나 수 밀리미터 범위의 수상돌기 분지(dendritic arbor)와 같은 큰 구조물을 촬영할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 가능한 한 가장 깨끗하고 무균 상태인 환경에서 작업하고, 손을 매우 안정적으로 유지하는 것이 중요합니다. 이것으로 모두 끝났습니다.시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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