Name: 오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 DNA 추출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T15:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 배우세요 매트릭스 기반 DNA 추출법으로 오염 제거된 객담 샘플에서 Mycobacterium tuberculosis의 표적 차세대 염기서열분석을 위한 고순도 DNA를 효율적으로 분리하는 최적화된 방법을 확인하세요.

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이 연구는 스텔렌보스 대학교의 연구 윤리 위원회: 생물 및 환경 안전(REC: BES): BES-2024-25384 및 인간 연구 윤리 위원회: N21/09/093 및 N09/11/296의 승인을 받았습니다.
1. 가래 침전물 시료 준비
참고: 다음 단계는 DNA 추출 전에 생물 안전 레벨 3(BSL3) 실험실에서 수행해야 합니다.
<ol>
	<li>500 μL-2 mL를 1.5 mL 또는 2 mL low-bind tube로 옮겨 N-acetyl-L-L-cysteine(NALC) 및 수산화나트륨(NaOH)(NALC/NaOH)을 사용하여 이전에 오염을 제거한 객담 침전물 샘플의 부분 표본을 준비합니다.</li>
	<li>객담 침전물 샘플이 들어있는 튜브를 튜브 랙에 똑바로 세우고 샘플을 80 ° C의 오븐에 넣고 1 시간 동안 배양하여 열처리를 통해 마이코박테리아를 비활성화합니다.</li>
	<li>1시간 후 샘플이 든 튜브 랙을 제거하고 튜브 표면을 닦은 다음 생물 안전 레벨 2(BSL2) 실험실로 운송하기 위해 적절한 용기에 넣습니다. 알림: 샘플을 허용하십시오.amp추가 취급 또는 보관하기 전에 실온으로 식히십시오.</li>
</ol>
2. 매트릭스 현탁액과 고속 균질기를 사용한 DNA 추출(그림 2)
<ol>
	<li>시작하기 전에 2mm 직경의 유리 구슬 3개를 1.5 또는 2mL 나사 캡 튜브에 느슨하게 캡을 씌우고 오토클레이브를 추가합니다(이상적으로는 DNA 추출 하루 전).</li>
	<li>냉장고에서 매트릭스 현탁액을 제거하고 자석 교반기(시약 병에 자석이 포함되어 있음)에 올려 시약을 실온으로 가져오고 시약 혼합을 시작합니다.</li>
	<li>가열 블록을 켜고 56°C로 예열합니다(두 개의 가열 블록을 사용할 수 있는 경우 두 번째 가열 블록을 100°C로 예열합니다. 알림: 다음 단계는 BSL2 시설의 실험실 벤치에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>열이 비활성화된 가래 침전물 샘플을 16,800 × g (또는 최대 속도)으로 15분 동안 원심분리합니다. 20-200 μL 피펫으로 상층액을 부드럽게 흡입하고 폐기하여 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.</li>
	<li>매트릭스 현탁액을 부드럽게 흔들어 혼합하고(와류가 발생하지 않음) 잘 혼합된 매트릭스 200μL를 추가하여 펠릿을 재현탁합니다.</li>
	<li>직경 2mm의 사전 멸균된 유리 구슬 3개가 들어 있는 1.5mL 나사 캡 튜브에 전체 부피를 피펫으로 넣습니다.</li>
	<li>샘플을 가열 블록에 넣고 56°C에서 15분 동안 배양합니다. 알림: s를 제거한 직후amp가열 블록에서 가열 블록에서 하나의 가열 블록만 사용할 수 있는 경우 100단계 후에 가열 블록을 2.7°C로 설정하십시오.</li>
	<li>세포를 분산시키기 위해 10초 동안 와류를 사용하여 샘플을 균질화합니다.</li>
	<li>샘플을 가열 블록에 넣고 100°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음 매개변수를 가진 고속 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화합니다: 4.0m/s에서 60초의 1회 주기.</li>
	<li>12,000 × g 에서 5분 동안 원심분리기. 130 μL의 DNA 함유 상등액을 펠릿(세포 파편이 있는 매트릭스)을 방해하지 않고 새로운 1.5 mL 저결합 튜브로 옮깁니다. 매트릭스와 세포 파편이 들어 있는 첫 번째 튜브를 버립니다. 참고: 안전한 정지 지점. 중단하는 경우 DNA 정제를 계속할 준비가 될 때까지 -20 °C에서 샘플을 동결합니다.</li>
	<li>마그네틱 비드를 이용한 DNA 정제를 진행합니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig02v2.jpg"> 
그림 2: 고속 균질화기와 결합된 매트릭스 기반 DNA 추출 방법. 약어: HSH = 고속 균질화기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig02v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
3. 마그네틱 비드를 사용한 DNA 정제(그림 3)
참고: DNA 정제를 진행하기 전에 3.1 및 3.2 단계를 수행하십시오.
<ol>
	<li>냉장고에서 마그네틱 비드를 제거하고 용기를 실온에 30분 동안 두어 평형을 이룹니다. 또는 마그네틱 비드 스톡 병을 소용돌이치게 하여 모든 비드를 재현탁시키고 1,280μL 분취량을 새 튜브(21개 시료 정제용)로 흡인하고 실온에서 평형을 이룹니다.</li>
	<li>여과 및 멸균된 물 9mL에 순수 에틸 알코올 7.2mL를 첨가하여 80% 에탄올 9mL 배치를 준비합니다. 알림: 다음 단계는 BSL2 시설의 실험실 벤치에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>마그네틱 비드 스톡 병 또는 준비된 부분 표본을 철저히 소용돌이쳐 사용하기 전에 비드가 재현탁되도록 합니다. 균질한 현탁액을 보장하기 위해 10개의 샘플마다 와류를 반복합니다.</li>
	<li>추출된 DNA(130μL)에 마그네틱 비드의 1.2배(156μL)를 추가합니다. 참고: DNA(배양)가 더 많은 샘플의 경우 샘플의 더 작은 부분 표본을 처리하고(예: 50μL) 1.2배 부피의 마그네틱 비드로 정제할 수 있습니다.</li>
	<li>10회 피펫팅하여 샘플을 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 1.5mL 튜브 마그네틱 랙에 3분 동안 또는 액체가 투명해질 때까지 놓습니다. 조심스럽게 흡인하고 비드를 방해하지 않고 상등액을 버리십시오.</li>
	<li>자석에 튜브를 끼우고 200μL의 80% 에탄올을 첨가하여 비드가 방해받지 않고 30초 동안 배양할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>조심스럽게 흡인하고 구슬을 방해하지 않고 에탄올을 버리십시오.</li>
	<li>3.7단계를 반복하여 총 두 번 세탁합니다.</li>
	<li>두 번째 세척 후 에탄올을 제거하고 버립니다. 1-10 μL 피펫으로 잔류 에탄올을 제거합니다.</li>
	<li>튜브를 열어 두어 10분 동안 또는 비드가 무광택 모양이 될 때까지 비드를 자연 건조시킵니다. 알림: 구슬이 과도하게 건조되어 금이 가지 않도록 하십시오.</li>
	<li>비드가 무광택 모양이 되면 즉시 자석에서 튜브를 제거하고 각 샘플의 비드에 50μL의 뉴클레아제가 없는 물(NFW)을 직접 추가합니다. 모든 튜브에 NFW를 추가한 후 10회 피펫팅하여 각 개별 샘플을 혼합합니다. 튜브 내부에 붙어 있는 비드가 있는지 검사하고 필요한 경우 혼합 단계를 반복합니다. 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 참고: 배양 시간은 5분에서 10분으로 늘릴 수 있지만 배양 시간을 5분 미만으로 줄이지는 마십시오.</li>
	<li>튜브를 마그네틱 랙에 3분 동안 또는 액체가 맑아질 때까지 다시 놓습니다. 마그네틱 랙에 있는 튜브를 사용하여 DNA가 함유된 상등액을 명확하게 표시된 멸균 저결합 튜브로 옮깁니다. 비드가 상층액으로 옮겨지지 않도록 하십시오. 참고: 이송 중 피펫 팁에 비드가 보이면 상층액을 마그네틱 랙의 튜브에 다시 피펫으로 넣어 3분 더 분리하십시오. 비드를 새 튜브에 옮기지 마십시오. 안전한 정지 지점. 중단하는 경우 NGS에 적합한 방법을 사용하여 정량화를 계속하고 MTB tNGS 분석을 사용하여 후속 PCR 증폭을 계속할 준비가 될 때까지 샘플을 -20°C에서 동결합니다.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig03.jpg"> 
그림 3: 마그네틱 비드를 사용한 DNA 정제 및 농축. 약어: NFW = 뉴클레아제가 없는 물; tNGS = 표적 차세대 염기서열분석(targeted next-generation sequencing). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Global Tuberculosis Report 2024. Geneva: WHO. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024">https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2024</a> (2024).</li>
<li>De Araujo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+targeted+next-generation+sequencing+for+the+diagnosis+of+drug-resistant+tuberculosis+in+low-resource+settings%3A+a+programmatic+model%2C+challenges%2C+and+initial+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Implementation of targeted next-generation sequencing for the diagnosis of drug-resistant tuberculosis in low-resource settings: a programmatic model, challenges, and initial outcomes.</a> Front Public Health. 11, 1204064(2023).</li>
<li>Murphy, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+drug-resistant+Mycobacterium+tuberculosis+using+targeted+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Direct detection of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis using targeted next generation sequencing.</a> Front Public Health. 11, 1206056(2023).</li>
<li>Kambli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+next+generation+sequencing+directly+from+sputum+for+comprehensive+genetic+information+on+drug+resistant+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Targeted next generation sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drug resistant Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis. 127, 102051(2021).</li>
<li>WHO Consolidated Guidelines on Tuberculosis.Module 3: Diagnosis. Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Third edition. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/376221/9789240089488-eng.pdf?sequence=1</a> (2024).</li>
<li>Catalogue of mutations in Mycobacterium tuberculosis. complex and their association with drug resistance. Second edition. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/374061/9789240082410-eng.pdf?sequence=1</a> (2023).</li>
<li>Schwab, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+next-generation+sequencing+to+diagnose+drug-resistant+tuberculosis%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Targeted next-generation sequencing to diagnose drug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infect Dis. 24 (10), 1162-1176 (2024).</li>
<li>Deeplex Myc-TB manual version 5. , GenoScreen. 
 <a target="_blank" href="https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57">https://acrobat.adobe.com/link/track?uri=urn%3Aaaid%3Ascds%3AUS%3A67c2b53f-c91d-3a73-a6ea-4769e7c8fe57</a> (2023).</li>
<li>Shea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+whole-genome+sequencing+and+reporting+of+drug+resistance+profiles+on+clinical+cases+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+New+York+State%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive whole-genome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State.</a> J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).</li>
<li>Conceição, E. C., et al. Mycobacterium tuberculosis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConcei%C3%A7%C3%A3o%2C+EC+%22DNA+extraction+using+InstaGene+Matrix+and+high-speed+homogenizer+from+clinical+primary+culture%22">DNA extraction using InstaGene Matrix and high-speed homogenizer from clinical primary culture</a>. , https://www.protocols.io/view/mycobacterium-tuberculosis-dna-extraction-using-in-dhvs366e (2024).</li>
<li>Nilgiriwala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+from+sputum+for+tuberculosis+disease+diagnosis%2C+lineage+determination%2C+and+drug+susceptibility+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing from sputum for tuberculosis disease diagnosis, lineage determination, and drug susceptibility prediction.</a> J Clin Microbiol. 61 (3), e0157822(2023).</li>
<li>Laboratory Services in Tuberculosis Control Part II: Microscopy. Geneva: WHO. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2">https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/65942/WHO_TB_98.258_(part2).pdf?sequence=2</a> (1998).</li>
</ol>

2023년 전 세계적으로 약 370만 명의 결핵 환자가 진단과 치료를 받지 못한 것으로 추정되며, 이는 결핵이 전 세계 보건에 미치는 심각한 위협을 강조합니다1. WHO는 2023년에 약 400,000명이 리팜피신 내성(RR-TB) 또는 다제내성 결핵(MDR-TB)에 걸린 것으로 추정합니다1. 결핵 및 DR-TB를 신속하게 진단하고 치료하는 것은 결핵 발병률 및 사망률을 줄이기 위한 이정표와 목표를 달성하는 데 필수적입니다1.
기존 배양 방법과 표현형 약물 감수성 검사(pDST)에 의존하면 임상 분리 및 치료의 내성 프로필 결정이 지연되고 처리 시간이 6-8주가 소요되며 복잡한 생물 봉쇄 인프라가 필요합니다. DR-TB의 NGS와 함께 정기 진단 검사를 통해 포괄적인 약물 내성 프로파일을 제공하고 MDR-TB 요법의 개인화를 개선할 수 있으며, 효과적인 치료 기간을 몇 주 또는 몇 개월에서 며칠로 단축할 수 있습니다 2,3,4.
2023년과 2024년에 WHO는 1차 및 2차 항결핵제에 대한 감수성을 신속하게 결정하기 위해 tNGS를 새로운 진단 범주로 사용할 것을 권장했습니다5. 따라서 생물안전성 레벨 3(BSL-3) 실험실에서 Mycobacterium tuberculosis (MTB) 배양 없이 치료 결정을 안내하는 데 유용한 도구입니다. tNGS 접근법은 중합효소연쇄반응(PCR)을 사용하여 염기서열분석 전에 약물 내성을 부여하는 유전자 표적을 증폭하는 압축된 형태의 염기서열분석입니다. WHO에서 권장하는 tNGS 검사 중 리팜피신, 이소니아지드, 에탐부톨, 피라진아미드, 플루오로퀴놀론, 아미카신, 스트렙토마이신, 리네졸리드, 베다퀼린, 클로파지민에 대한 내성 검출을 위한 등급 기반 기준을 충족하는 것으로 보고된 Deeplex Myc-TB 분석을 선택했습니다. 당사는 이 분석을 사용하여 다운스트림 tNGS에 대한 이 프로토콜을 사용하여 추출한 DNA의 적합성을 평가합니다.
또한, WHO는 MTB의 약물 내성과 관련된 돌연변이 목록2판을 발행하여 약물 감수성을 예측하고 치료를 안내하기 위한 전체 게놈 염기서열 분석(WGS) 및 tNGS의 사용에 대한 로드맵을 제공했습니다6. 최근의 체계적 문헌고찰 및 메타분석에 따르면 tNGS는 mMTB 게놈의 다양한 내성 부여 영역에 있는 23개의 표적을 기준으로 pDST7에 비해 약물 내성 검출에 대한 민감도와 특이도가 각각 94.1%와 98.1%인 것으로 나타났습니다.
그러나 이러한 방법의 구현은 필요한 워크플로, 인프라 및 장비와 특히 관련된 복잡성과 비용으로 인해 여전히 어렵습니다. 중요한 과제는 오염이 제거된 가래의 침전물에서 직접 충분한 고품질 마이코박테리아 DNA를 분리하는 것이며, 이는 다운스트림 tNGS 응용 분야를 위한 중요한 단계입니다. 이를 해결하기 위해 tNGS에 맞춘 빠르고 간단한 DNA 추출 방법을 제시합니다.
선택한 MTB tNGS 분석에 대한 표준화된 DNA 추출 방법에는 사내 수동 및 자동 프로토콜8이 포함됩니다. 여기에서는 단순화된 매트릭스 기반 DNA 추출 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1). 이 방법은 금속과 단백질을 결합하여 오염이 제거된 가래 침전물에서 직접 고품질 핵산을 추출할 수 있는 InstaGene 매트릭스(IGM)를 사용합니다. 이 대안은 더 빠른 처리 시간과 다운스트림 tNGS를 위한 충분한 DNA 수율을 제공합니다. 이 프로토콜은 수동 및 자동 분석법의 복잡성을 극복하는 동시에 MTB에서 내성을 부여하는 변이체의 신속한 진단을 위해 고품질 tNGS를 보장합니다. 마이코박테리학 분야에서 tNGS 사용에 대한 관심이 높아짐에 따라 이 프로토콜은 일상적인 진단 워크플로우에 쉽게 채택할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig01.jpg"> 
그림 1: 매트릭스 현탁액을 사용하여 오염이 제거된 가래 침전물 샘플에서 마이코박테리아 DNA를 추출하는 방법의 개략도.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>대안: 벤치마크 BeadBlaster 24</td><td>벤치마크 사이언티픽</td><td>D2400</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 비드 기반 시약</td><td>베크만 쿨터</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>고압멸균 또는 멸균 유리 구슬(2mm)</td><td>시그마-알드리치</td><td>Z273627-1개</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올, 순수&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>필터 피펫 팁(10 & micro; L)</td><td>바이오 스마트 사이언티픽</td><td>FT-10-R</td><td></td></tr><tr><td>필터 피펫 팁(1000 & micro; L)</td><td>바이오 스마트 사이언티픽</td><td>FT1000-R</td><td></td></tr><tr><td>필터 피펫 팁(20 & micro; l)</td><td>바이오 스마트 사이언티픽</td><td>FT20-R</td><td></td></tr><tr><td>필터 피펫 팁(200 & micro; L)</td><td>바이오 스마트 사이언티픽</td><td>FT200-R</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg 범위의 가열 블록; C에서 100 &deg; C&nbsp;</td><td>에펜도르프</td><td>5382000031</td><td></td></tr><tr><td>고속 균질화기(HSM) - FastPrep-24</td><td>MP 바이오메디컬</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 80 &g; C</td><td>라섹 그룹</td><td>IBLPDHG-9030A</td><td></td></tr><tr><td>InstaGene 매트릭스</td><td>바이오 래드 연구소 Inc.</td><td>BBRD7326030</td><td></td></tr><tr><td>저결합 마이크로튜브(1.5mL 또는 2mL)</td><td>에펜도르프</td><td>EP0030108051-250개</td><td></td></tr><tr><td>1.5 &ndash용 마그네틱 선반; 2mL 튜브</td><td>써모 피셔 사이언티픽 Inc.</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱 교반기</td><td>머 크</td><td>Z671886</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>에펜도르프</td><td>5406000046</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q IX 7015 순수 정화 시스템</td><td>머 크</td><td>ZIX7015T0C</td><td></td></tr><tr><td>뉴클레아제가 없는 물(NFW), 분자 등급</td><td>써모 피셔 사이언티픽 Inc.</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>피펫(P10, P20, P200 및 P1000)</td><td>에펜도르프</td><td>EP3123000918-1개</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 분석 튜브</td><td>써모 피셔 사이언티픽 Inc.</td><td>질문32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 분석 키트</td><td>써모 피셔 사이언티픽 Inc.</td><td>질문33231</td><td></td></tr><tr><td>큐비트 형광계 기기</td><td>써모 피셔 사이언티픽 Inc.</td><td>질문33226</td><td></td></tr><tr><td>스크류 캡 튜브(1.5mL)</td><td>사이언티픽 스페셜티 Inc.</td><td>P2TUB056C-0001.5ST</td><td></td></tr><tr><td>소용돌이</td><td>라섹 그룹</td><td>WMBB0L0E0216</td><td></td></tr></tbody></table>

오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 dna 추출

Matrix-based DNA Extraction for Targeted Next-Generation Sequencing on Decontaminated Sputum Samples

샘플 설명 박테리아 부하가 1+ 이상인 현미경 검사에서 AFB(Acid-fast Bacilli)에 양성인 총 165개의 가래 침전물 샘플이 남아프리카 케이프타운의 NHLS(National Health Laboratory Services) Green Point에서 정기적으로 수집 및 처리되었습니다. 두 가지 다른 부피[약 2mL(n = 102) 및 500μL(n = 63)]를 사용하여 가래 침전물 샘플에서 DNA를 추출했습니다. 이 비교는 더 작은 퇴적물 샘플 부피가 다운스트림 tNGS에 충분한 DNA를 생성할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 수행되었습니다.
그림 4는 다양한 객담 도말 등급(1+, 2+ 및 3+)과 객담 침전물 부피(2mL 및 500μL)에 걸쳐 총 DNA 농도(ng/μL)의 상자 플롯 비교를 보여줍니다. DNA 수율은 일반적으로 추출을 위해 500μL의 침전물을 사용할 때 전체적으로 감소하며 도말 등급에 따라 변동성이 있습니다. 따라서, 부피가 2mL 이상인 퇴적물 샘플에서 추출한 평균 DNA 농도는 샘플의 AFB에 의해 계층화된 500μL 퇴적물에서 추출한 DNA 농도보다 평균적으로 높았습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig04.jpg"> 
그림 4: 도말 등급에 걸쳐 DNA 수율에 대한 가래 침전물의 양이 미치는 영향.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 5는 두 가지 다른 주입량(2mL 및 500μL)에서 처리된 다양한 도말 등급(1+, 2+ 및 3+)을 가진 객담 침전물 샘플에 대한 모든 표적의 평균 염기서열분석 판독 수(평균 커버리지 깊이)를 보여주는 상자 그림을 보여줍니다. 이상값은 개별 점으로 표시되며, y축은 적용 범위의 변동을 수용하기 위해 로그 눈금으로 표시됩니다. 500μL 퇴적물에서 추출한 3+ 샘플의 높은 사분위수 범위는 더 높은 박테리아 부하에서 더 큰 변동성을 시사합니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig05.jpg"> 
그림 5: 도말 등급과 시료 주입량에 걸쳐 모든 표적에 대한 평균 염기서열분석 판독 수(coverage depth) 비교. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그림 6은 관련 웹 애플리케이션의 생물정보학 파이프라인을 사용하여 염기서열분석 결과의 수용 가능성을 평가한 것을 보여줍니다. 염기서열분석 품질 점수는 +++(매우 수용 가능), ++(수용 가능), +(약간 수용 가능), -(수용 불가) 및 ND(결정되지 않음)로 분류됩니다. 그래프에 막대가 없으면 해당 특정 범주에 대한 결과를 얻지 못했음을 나타냅니다. 도말 등급 1+는 500μL 투입량 시료 세트에 대한 도말 등급 2+ 및 3+에 비해 허용되지 않는 ND 결과의 비율이 더 높다는 것을 보여줍니다. 500μL의 가래 침전물에서 추출한 샘플의 평균 염기서열분석 범위 깊이는 4,316인 반면, 2mL 가래 침전물에서 추출한 샘플의 경우 4,810이었습니다. 이는 객담 퇴적물에서 추출한 DNA가 투입량에 관계없이 다운스트림 tNGS를 수행하기에 적합했음을 시사합니다.
염기서열분석 결과의 수용 가능성의 분포에 기초하여, 도말 등급이 3+인 샘플은 1+ 및 2+ 도말 등급 샘플에 비해 ++ 및 +++로 점수가 매겨진 대부분의 샘플 염기서열에서 가장 높은 성공률을 보였습니다. 500μL 입력 샘플의 경우 - 및 + 범주의 샘플 비율은 2mL 입력 샘플에 비해 모든 도말 등급에서 상대적으로 높습니다. 이는 더 많은 샘플이 500μL 입력에 대해 품질이 낮고 수용 수준이 낮은 범주에 속한다는 것을 시사합니다. 2mL 입력 샘플의 경우, 특히 도말 등급 3+의 경우 고품질 ++ 및 +++ 범주의 샘플의 비율이 더 높습니다. 이는 2mL 입력의 샘플이 500μL 입력의 샘플에 비해 더 나은 염기서열분석 품질 점수를 생성할 가능성이 더 높다는 것을 시사합니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68147/68147fig06.jpg"> 
그림 6: 도말 등급 및 샘플 입력 볼륨에 따른 품질 점수 분포.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68147/68147fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 DNA 추출

Next-generation sequencing (NGS) is now recognized as a powerful tool for timely and accurate drug-resistant tuberculosis (DR-TB) diagnosis. Targeted NGS ...

우리의 연구는 맞춤형 환자 치료를 위해 NGS를 통합하여 결핵 진단 및 후속 시작의 처리 시간을 줄이는 것입니다. 당사의 프로토콜은 진단 지연을 줄이고 적시에 치료 시작을 개선하는 것을 목표로 워크플로 통합, 비용 및 처리 시간을 해결하여 일상적인 사용을 위해 TNGS를 최적화합니다.이 프로토콜은 최대 3일이 소요되는 기존 CTAB 방법에 비해 몇 시간 내에 임상 샘플에서 비용 효율적이고 신속하며 충분한 품질의 DNA 추출을 가능하게 합니다.우리의 결과는 TNGS를 일상적인 진단에 통합하고 도말 음성 및 부족한 샘플에 대한 추출 방법을 최적화하여 민감도와 임상적 유용성을 향상시키는 데 대한 주요 질문을 제기합니다. 우리는 결핵 게놈 감시를 간소화하고 확장하기 위해 가래의 직접 전체 게놈 시퀀싱을 포함하여 일상적인 진단의 잔여 샘플을 다운스트림 시퀀싱에 사용할 수 있는지 여부를 조사할 것입니다.[해설자] 시작하려면 열에 비활성화된 가래 침전물을 얻으십시오. 샘플을 16,800G 또는 최대 속도로 15분 동안 원심분리합니다. 20-200마이크로리터 피펫을 사용하여 상청액을 부드럽게 흡인하고 버려 펠릿이 방해받지 않도록 합니다. 매트릭스 현탁액을 부드럽게 흔들어 혼합한 다음 잘 혼합된 매트릭스 200마이크로리터를 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. 전체 부피를 직경 2mm의 사전 멸균된 유리 구슬 3개가 들어 있는 1.5밀리리터 스크류 캡 튜브로 옮깁니다. 이제 샘플을 섭씨 56도의 가열 블록에 15분 동안 넣습니다. 배양 후 10초 동안 소용돌이로 샘플을 균질화하여 세포를 분산시킨 다음 샘플을 섭씨 100도의 가열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 초당 4.0미터에서 60초의 한 사이클로 고속 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화합니다. 그런 다음 현탁액을 12,000G에서 5분 동안 원심분리합니다. 130마이크로리터의 DNA 함유 상청액을 펠릿을 방해하지 않고 신선한 1.5밀리리터 저결합 튜브로 옮깁니다. 매트릭스와 세포 파편이 들어 있는 첫 번째 튜브를 폐기하십시오. 마그네틱 비드를 사용하여 DNA를 정제하려면 먼저 마그네틱 비드 스톡 병 또는 준비된 분취량을 완전히 소용돌이치게 하여 사용하기 전에 비드를 재현탁시킨 다음 추출된 DNA에 마그네틱 비드 부피의 1.2배를 첨가하고 현탁액을 10회 피펫팅하여 샘플을 혼합한 후 실온에서 5분 동안 배양합니다. 샘플을 1.5밀리리터 튜브 마그네틱 랙에 3분 동안 또는 액체가 투명해질 때까지 놓은 다음 비드를 방해하지 않고 조심스럽게 상청액을 흡인하고 버립니다. 자석에 튜브를 대고 200마이크로리터의 80% 에탄올을 추가하여 비드가 방해받지 않도록 합니다. 30초 동안 배양한 후, 구슬을 방해하지 않고 에탄올을 조심스럽게 흡인하고 버립니다. 두 번째 세척 후 1-10마이크로리터 피펫을 사용하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 튜브를 열어 두어 10분 동안 또는 무광택 모양이 될 때까지 비드를 자연 건조시킵니다. 비드가 무광택 모양이 되면 자석에서 튜브를 제거하고 각 샘플의 비드에 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물을 직접 추가합니다. 그런 다음 피펫팅하여 각 개별 샘플을 10회 혼합합니다. 튜브 내부에 구슬이 끼어 있는지 검사하십시오. 실온에서 5분 동안 배양한 후 튜브를 마그네틱 랙에 다시 놓거나 액체가 투명해질 때까지 3분 동안 놓습니다. 마그네틱 랙에 튜브를 사용하여 DNA 함유 상청액을 명확하게 표시된 멸균 저결합 튜브로 옮깁니다. DNA 농도는 모든 도말 등급에서 500마이크로리터에 비해 2밀리리터 침전물 샘플에서 더 높았습니다. DNA 수율의 더 큰 변동성은 500마이크로리터 침전물 샘플에서 관찰되었습니다. 시퀀싱 판독의 적용 깊이는 모든 도말 등급에서 500마이크로리터에 비해 2밀리리터 침전물 샘플에서 더 높았습니다. 변동성은 500마이크로리터 퇴적물에서 추출한 3개 이상의 도말 등급 샘플에서 더 컸습니다. 시퀀싱 수용 가능성 점수는 일반적으로 500마이크로리터에 비해 2밀리리터 샘플에서 더 높았으며 매우 수용 가능한 결과의 비율이 더 높았습니다. 도말 등급 3 이상 샘플은 도말 등급 1 플러스 및 2 플러스에 비해 허용 가능한 결과의 비율이 가장 높았습니다. 500마이크로리터 샘플에는 허용되지 않거나 결정되지 않은 것으로 분류된 사례가 더 많았습니다.

matrix-based-dna-extraction-for-targeted-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

설명이 쉽고 밀도에 독립적 인 강화를위한 비오틴 링커를 전송할 클릭 화학에 이어, 5 HMC에 azide - 포도당를 전송하는 β-glucosyltransferase (β-GT)를 사용하여 두 단계 라벨 프로세스입니다. 이 효율적이고 특정 라벨 방식은 차세대 시퀀싱을 통해 매우 낮은 배경과 높은 처리량 epigenomic 매핑과 5 HMC의 농축이 가능합니다.

게놈 DNA에서 도보로 5 hydroxymethylcytosine의 선택적 캡처

타액에서 DNA를 추출하면 분해/단편화가 거의 또는 전혀 없이 쉽게 구할 수 있는 고분자량 DNA를 제공할 수 있습니다.  이 프로토콜은 타액 채취/저장 및 DNA 추출을 위한 최적화된 매개변수를 제공하여 고품질 요구 사항을 가진 다운스트림 DNA 분석을 위한 충분한 품질과 양을 제공합니다.

차세대 시퀀싱에 대한 수집 및 타액 DNA의 추출

NGS 염기서열분석을 위한 gDNA 농축은 체질적 돌연변이 연구를 위한 쉽고 강력한 도구입니다. 이 기사에서는 DNA 손상 복구에 관여하는 11개 유전자의 전체 염기서열을 간단히 분석하는 절차를 제시합니다.

의 전체 순서의 NGS 분석을위한 Transposase 기반 기술에 의해 gDNA를 농축 BRCA1 BRCA2, 9 유전자

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing은 시토신 중아황산염 변환과 결합된 제한 효소 분해를 기반으로 DNA 메틸화 분석을 위한 염기서열분석 라이브러리를 준비하는 방법입니다. 이 프로토콜은 50ng의 시작 물질이 필요하며 GC가 풍부한 게놈 영역에서 염기쌍 분해능 데이터를 생성합니다.

자료 쌍 해상도에서 DNA 메틸화의 평가에 대한 표현 바이 설 파이트 시퀀싱을 감소 향상

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

이 프로토콜은 DNA 캡처 비드 정제와 결합된 비드 박팅이 Mycobacterium tuberculosis 샘플에서 DNA를 추출하기 위한 빠르고 일관된 방법을 제공하여 차세대 염기서열분석 응용 분야에 효과적인 선택임을 보여줍니다.

맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 Mycobacterial DNA 추출 후 NGS 워크플로우

배우세요 매트릭스 기반 DNA 추출법으로 오염 제거된 객담 샘플에서 Mycobacterium tuberculosis의 표적 차세대 염기서열분석을 위한 고순도 DNA를 효율적으로 분리하는 최적화된 방법을 확인하세요.

오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 DNA 추출

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