Name: 녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 배우세요 I-GONAD 방법을 활용한 생체 내 전기천공 기술로 녹아웃 마우스를 효율적으로 생성하는 방법. CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집으로 동물 사용을 최소화하고 연구 윤리를 개선합니다.

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<ol><li>Fujihara, Y., Ikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-Based+Genome+Editing+in+Mice+by+Single+Plasmid+Injection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection.</a> Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).</li>
<li>Zuo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+complete+gene+knockout+mice+and+monkeys+by+CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+with+multiple+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs.</a> Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).</li>
<li>Hubrecht, R. C., Carter, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3Rs+and+humane+experimental+technique%3A+Implementing+change%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change.</a> Animals. 9 (10), 754(2019).</li>
<li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+i-GONAD+suitable+for+production+of+genome-edited+C57BL%2F6+inbred+mouse+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain.</a> Cells. 9 (4), 957(2020).</li>
<li>Takabayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+i-GONAD+in+mice+at+early+zygote+stage+through+in+vivo+electroporation+three+minutes+after+intra-oviductal+instillation+of+CRISPR-ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein.</a> Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+i-GONAD%3A+An+improved+in+vivo+technique+for+CRISPR%2FCas9-based+genetic+manipulations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice.</a> Cells. 9 (3), 546(2020).</li>
<li>Kessler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiple+super-enhancer+region+establishes+inter-TAD+interactions+and+controls+Hoxa+function+in+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest.</a> Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).</li>
<li>Kaneko, T., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+genome+editing+by+electroporation+using+embryos+artificially+removed+cumulus+cells+in+the+oviducts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts.</a> Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+CRISPR-based+germline-genome-engineered+mice+without+ex+vivo+handling+of+zygotes+by+i-GONAD%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((i-GONAD%3A+A+robust+method+for+in+situ+germline+genome+engineering+using+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases.</a> Genome Biol. 19 (1), 25(2018).</li>
<li>Marshall, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PerlPrimer%3A+Cross-platform%2C+graphical+primer+design+for+standard%2C+bisulphite+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR.</a> Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).</li>
<li>Truett, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+Tris+%28HotSHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT).</a> BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+evaluation+of+CRISPR+genome+editing+by+TIDE+and+TIDER%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Gene+Editing%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER.</a> CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).</li>
<li>Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+editing+in+wild+strains+of+mice+using+the+i-GONAD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method.</a> Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).</li>
<li>Iwata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+large-scale+chromosomal+engineering+of+mouse+zygotes+viain+vitro+and+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation.</a> Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).</li>
<li>Abe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+large-fragment+knock-in+animal+production+without+ex+vivo+handling+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes.</a> Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).</li>
<li>Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+cortical+electroporation+of+plasmids+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5&ndash; 5 uL 피펫&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>4642020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td><td>압타카</td><td>1003/G</td><td></td></tr><tr><td>100-1000 uL 피펫 & nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>200 uL 튜브</td><td>악시겐</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>20-200 uL 피펫 & nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>2-20 uL 피펫 & nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>4x 젤 로딩 다이</td><td>바이오랩믹스</td><td>D-3002</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase 없는 (1 U/&mu; L)</td><td>써모피셔</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 세트, 100 mM 솔루션</td><td>써모 사이언티픽</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq 그린 DNA 중합효소 (5 U/&mu; L)</td><td>써모 사이언티픽</td><td>EP0713</td><td></td></tr><tr><td>둘벡코 s 수정 인산염 완충 식염수</td><td>시그마 올드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>에디트코 ICE 분석</td><td>https://ice.editco.bio/#/</td><td></td><td>2025년 4월 6일 접속</td></tr><tr><td>EDTA 0.5M 용액, pH = 8</td><td>AppliChem</td><td>A4892,0500</td><td></td></tr><tr><td>앙상블</td><td>그리고 nbsp; https://www.ensembl.org/index.html</td><td></td><td>2025년 6월 9일에 접속함</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드</td><td>바이오랩믹스</td><td>에트브르-10</td><td></td></tr><tr><td>아이 젤 점안액 " 오프타젤"</td><td>URSAPHARM</td><td>204604</td><td></td></tr><tr><td>겔 문서화 시스템 ChemiDoc XRS+</td><td>바이오-래드</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>실리코 PCR V39x1&nbsp;</td><td>https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr</td><td></td><td>그리고 nbsp; 2025년 6월 9일에 접속함</td></tr><tr><td>통합 DNA 기술&nbsp;</td><td>https://eu.idtdna.com</td><td></td><td>2025년 6월 9일에 접속함</td></tr><tr><td>미세수술 가위</td><td>메딘 우랄</td><td>M124</td><td></td></tr><tr><td>NEPA21 전기공공기</td><td>네파 유전자</td><td>NEPA21</td><td>CUY652P2.5X4 전극</td></tr><tr><td>NTP 집합, 100 mM 해법</td><td>써모 사이언티픽</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>올리고뉴클레오타이드</td><td>에브로겐</td><td></td><td>직접 주문, 표준 탈염 정제</td></tr><tr><td>옵티-MEM I 환원 혈청 배지</td><td>써모피셔</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>펄프라이머</td><td>https://perlprimer.sourceforge.net</td><td></td><td>버전 1.1.21.</td></tr><tr><td>Phusion 고충도 DNA 중합효소 (2 U/&mu; L)</td><td>써모 사이언티픽</td><td>F530L</td><td></td></tr><tr><td>피펫 10 uL 팁</td><td>울플라스트</td><td>HT-10-960</td><td></td></tr><tr><td>피펫 1000 uL 팁</td><td>울플라스트</td><td>HT-1000-576</td><td></td></tr><tr><td>피펫 200 uL 팁</td><td>울플라스트</td><td>HT-200-960</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치 엘프-4"</td><td>DNA 기술</td><td>PS-400 신규</td><td></td></tr><tr><td>RNAse/DNAse 자유수</td><td>인비트로젠</td><td>10977049</td><td></td></tr><tr><td>식염수 용액</td><td>팬에코</td><td>P011n</td><td></td></tr><tr><td>SE-1 흉측 전기영동 시스템</td><td>헬리콘</td><td>SE-1</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-올드리치</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>Step100 DNA 사다리</td><td>바이오랩믹스</td><td>S-8100</td><td></td></tr><tr><td>입체현미경 SMZ1000</td><td>니콘</td><td>5-363376</td><td></td></tr><tr><td>스트리퍼 마이크로피페터</td><td>쿠퍼 서저리</td><td>MXL3-STR</td><td></td></tr><tr><td>스트리퍼 팁</td><td>오리지오</td><td>MXL3-125</td><td></td></tr><tr><td>외과용 주사기&nbsp;</td><td>KMIZ</td><td>4A1- 0,6&times; 20</td><td></td></tr><tr><td>겸자 봉합</td><td>메딘 우랄</td><td>M302.2</td><td></td></tr><tr><td>겸자 봉합</td><td>메딘 우랄</td><td>M303</td><td></td></tr><tr><td>봉합 실 POLYCON N<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68704/68704eq1.jpg" style="margin: auto; "/>0</td><td>톤조스 95</td><td>234</td><td></td></tr><tr><td>SYNTHEGO 녹아웃 가이드 디자인&nbsp;</td><td>https://design.synthego.com/#/</td><td></td><td>2025년 6월 9일에 접속함</td></tr><tr><td>T100 증폭기</td><td>바이오래드</td><td>10014822</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 중합효소&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>TBE 10배 버퍼</td><td>바이오랩믹스</td><td>TBE-500</td><td></td></tr><tr><td>타이드&nbsp;</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td>2025년 6월 4일 접속 & nbsp;</td></tr><tr><td>트리스 하이드로클로라이드</td><td>쑤저우 야쿠 과학</td><td>SYS-S0005-0.5</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 염산염 용액</td><td>시그마 올드리치</td><td>T2663</td><td></td></tr><tr><td>트리졸 시약</td><td>인비트로젠</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>트루컷 Cas9 단백질</td><td>인비트로젠</td><td>A36499</td><td></td></tr><tr><td>범용 가위</td><td>메딘 우랄</td><td>M147</td><td></td></tr><tr><td>자일라진</td><td>Interchemie Werken de Adelaar</td><td>IX2</td><td></td></tr><tr><td>졸레틸</td><td>버박 연구소</td><td>2000443714739.00</td><td></td></tr></tbody></table>

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery-based In Vivo Electroporation Technique for Knockout Mice Generation

Methods for creating knockout mice typically involve three main steps: (1) collecting embryos from donor females, (2) microinjecting genetic constructs ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을...

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

여기에서, 우리는 1 세포 배아의 동결 보존을 위한 수정된 방법 뿐만 아니라 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 동결 해동 된 배아 및 전기 천공의 사용을 결합하는 프로토콜을 제시한다.

유전자 변형 마우스의 고효율 생산을 위한 동결 해동 배아 사용

현재 프로토콜은 유전자 카세트 knock-in 및 floxed 마우스를 효율적으로 생산하기 위한 CRISPR-Cas9 및 기증자 DNA의 접합체 미세주입을 설명합니다.

생쥐에서 유전자 카세트 knock-in 및 Flox 대립 유전자를 생성하기위한 접합체 미세 주입

여기에서는 CRISPR RNP 접합체 전기천공(CRISPR-EZ)이라고 하는 유전자 변형 마우스의 효율적인 생성을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 이 방법은 100%에 가까운 효율로 배아에 전기천공을 통해 편집 시약을 전달합니다. 이 프로토콜은 포유류 배아의 점 돌연변이, 작은 게놈 삽입 및 결실에 효과적입니다.

접합체의 CRISPR 전기천공에 의한 마우스의 효율적인 게놈 편집

여기에서는 배아 줄기 세포를 사용하여 유전자 변형 마우스 모델, 특히 대형 DNA 녹인 (KI)을 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 조정되어 기존의 상동 재조합 매개 선형화된 DNA 표적화 방법에 비해 KI 효율이 크게 향상되었습니다.

유전자 조작 마우스 모델 개발을 위한 배아 줄기 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 고효율 유전자 표적화

이 프로토콜은 마우스 난관에서 국소적으로 제한된 CRISPR 매개 게놈 편집을 위한 미세주입 및 생체 내 전기천공을 설명합니다.

생체 내 미세주입 및 전기천공을 사용한 체세포 게놈 공학 마우스 모델

이 프로토콜은 유전자 변형 쥐 모델을 생산하기 위한 최적화된 접근 방식을 제시합니다. 아데노 관련 바이러스(AAV)는 DNA 복구 템플릿을 전달하는 데 사용되며, 전기천공법은 CRISPR-Cas9 시약을 전달하여 2세포 배아에서 게놈 편집 과정을 완료하는 데 사용됩니다.

아데노 관련 바이러스(AAV) 및 2세포 배아 전기천공법을 이용한 쥐 배아의 CRISPR-Cas9 게놈 편집

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

배우세요 I-GONAD 방법을 활용한 생체 내 전기천공 기술로 녹아웃 마우스를 효율적으로 생성하는 방법. CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집으로 동물 사용을 최소화하고 연구 윤리를 개선합니다.

녹아웃 마우스 생성을 위한 난관 핵산 전달 기반 생체 내 전기천공 기술을 통한 개선된 게놈 편집

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