Name: Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 41 s
Description: Leer een microfluïdische chip voor enkele celanalyse met fluorescentie- en immunoassays. Deze methode kwantificeert intracellulaire eiwitten en enzymen met hoge precisie en specifiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zeer erkentelijk voor Tom Robinson voor het proeflezen van het manuscript, C. Bärtschi en H. Benz voor de bouw van de custom-built drukregelsysteem. We willen ook graag het gebruik van de clean room faciliteit FIRST en het Licht Microscopie Centrum (LMC), zowel bij ETH Zürich erkennen. Het werk werd gefinancierd door Merck Serono en de European Research Council (ERC) in het kader van het 7e Kaderprogramma (ERC Starting Grant, project geen. 203.428, nμLIPIDs).

1. SU-8 master Fabrication Bereid zowel de master vormen voor de kanalen (vloeibare en controle voor schema en afmetingen zie figuur 2) met het volgende protocol maar met verschillende maskerpatronen. Het proces is weergegeven in figuur 3a. <ol><li> Begin met het verwarmen van een 4 inch siliciumwafel gedurende 10 minuten bij 180 ° C. Laad de gedehydrateerde wafer op een spin-coater en gebruik de volgende protocol voor spin-coating SU-8 2015: <ol><li> Spin wafer bij 100 rpm gedurende 20 sec (open deksel van spin-coater, afzien SU-8 tijdens deze stap, sluit het deksel na het afgeven). </li><li> Spin wafer bij 500 rpm gedurende 10 seconden (dit zal verspreiden de resist over de gehele wafer). </li><li> Spin wafer bij 1.750 rpm gedurende 30 seconden (definieert de hoogte van de resist tot 20 urn). </li></ol></li><li> Verwijder weerstand van de rand van de wafel met aceton (gebruik een staafje), aangezien dit anders blijft plakken aan de warmhoudplaat in de volgende stap. Breng de wafer te ahotplate bij 95 ° C en verwarm gedurende 4 minuten. Na de softbake, bloot het weerstaan ​​door een photomask geplakt is aan glas in een masker aligner Sodalime met UV-licht (150 mJ / cm 2, gemeten bij 365 nm). </li><li> Na de belichting Verhit de wafer opnieuw bij 95 ° C gedurende 5 minuten op een kookplaat. Afkoelen van de wafer tot kamertemperatuur en vervolgens ondergedompeld in een bad van SU-8 ontwikkelaar voor 4 min. Schud zachtjes om onbelicht SU-8 te verwijderen. Was de wafer met cleanroom kwaliteit isopropanol en droog blazen met stikstof. Controleer onder een microscoop als de succesvolle ontwikkeling (vooral de cel vallen) was. Als de cel vallen volledig ontwikkeld, moet de reflectie van de siliciumwafel zichtbaar. Eventueel de ontwikkeling van de wafer weer enkele minuten. </li><li> Bak de wafer in een oven gedurende 2 uur bij 180 ° C om alle achtergebleven oplosmiddel te verwijderen. Controleer de hoogte van de kanalen met een stap profiler. Als de hoogte afwijkt van de gewenste hoogte, herhaal dit protocol te beginnen bij stap 1.1 een nieuwe wafer ende spin-snelheid (stap 1.1.3) veranderen. Afronding van de fabricage van de meester mal door silaniseren de wafer met 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silaan in een exsiccator overnachten. </li></ol> 2. Master Fabrication voor Microcontact Printing <ol><li> Om meester mallen bereiden microcontact drukken, gedehydreerd een silicium wafer gedurende 10 minuten bij 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS op dit wafer bij 7.500 tpm gedurende 30 seconden (de resist hecht beter om een ​​gesilaniseerd oppervlak). Spin-coat 2 ml AZ1518 positieve weerstaan ​​met dit protocol: <ol><li> Statische afgifte van de resist op de wafer. </li><li> Spin wafer gedurende 5 seconden bij 500 tpm. </li><li> Spin wafer gedurende 60 seconden bij 4000 tpm. </li></ol></li><li> Na 50 seconden softbake bij 100 ° C op een kookplaat, bloot de resist aan UV-licht (21 mJ / cm 2 bij 365 nm) door een fotomasker en een masker aligner. Ontwikkel de resist in een bad van AZ 726 voor 75 sec. Spoel de ontwikkelde wafer met DI-water en blaas dry met stikstof. Resten oplosmiddel door verhitting van de wafer bij 115 ° C gedurende 50 sec. Silaniseren de wafer onder vacuüm gedurende de nacht. </li></ol> 3. Fabricage van de Microfluidic Chip Een tweelaags apparaat ontwerp wordt gebruikt voor deze experimenten. De twee lagen worden afzonderlijk bereid en aan elkaar gehecht voordat de chip eindelijk gebonden op een glasplaatje (figuur 3b). Deze stap beschrijft de productie van de PDMS lagen en PDMS stempel voor microcontact afdrukken. <ol><li> Bereid een 10:01 mengsel van PDMS en verharder. Bereid ongeveer 80 g PDMS in totaal (met behulp van onze ontwerpen, zal dit resulteren in 10 chips). Meng beide delen krachtig en ontgassen het PDMS tot het mengsel is luchtbel vrij (~ 30 min). </li><li> Plaats de wafer met de besturingslaag in een petrischaaltje tape op de bodem. Vervolgens giet ~ 50 g PDMS boven en zet de wafer gedurende minstens 2 uur in een oven bij 80 ° C volledig te verzekerenuitharden van de PDMS. Herhaal dezelfde procedure voor de microcontact afdrukken wafer, voor dit ~ 20 g PDMS nodig is. </li><li> Spin-coat PDMS op de wafer met de vloeibare laag bij een rotatiesnelheid van 2000 rpm tot een ongeveer 40 urn hoog PDMS laag. Hard de PDMS in een oven gedurende ten minste 1 uur bij 80 ° C. </li><li> Wanneer beide delen uitgehard, verwijder de laag van de wafel en in stukken gesneden met een scheermesje. Punch druk aansluiting gaten met behulp van een 1 mm biopsie puncher. Voor opslag, is het raadzaam om een ​​stuk tape over de kanalen zetten. </li><li> De twee lagen te binden, nemen de spin beklede wafer en het bovenste gedeelte en plaats ze in een plasma reiniger 23. Na plasma behandeling, snel uitlijnen beide onderdelen onder een microscoop met grote werkafstand. Voeg wat extra PDMS rond de geplaatste bovenste delen. Deze stap is niet verplicht, maar het de verwijdering van de PDMS van de wafel vergemakkelijkt. Plaats de wafer in een oven bij 80 ° C gedurende ten minste 1 uur. </li><li> Gebruik een scalpel aan de PDMS voorzichtig uit de wafer en de microchips te snijden. Punch toegang gaten voor de vloeibare verbindingen met een 1,5 mm biopsie puncher. </li><li> De PDMS chip is nu klaar en kan worden opgeslagen voor maanden. Optioneel: Als de chip wordt gebruikt met een reservoir, snijd het bovenste deel van een 200 ul pipet tip en gebruik wat extra, semi-uitgeharde PDMS te lijmen op de top. Plaats de chip in de oven opnieuw bij 80 ° C gedurende tenminste 1 uur. </li></ol> 4. Bonding naar Glass Slide Om het apparaat te gebruiken voor directe enzymatische assays, de enige stap vereist na hechting is het blokkeren van oppervlakken. Voor dit protocol, ga dan naar A. Echter, om de microfluïdische chip voor immunoassays of ELISA&#39;s gebruiken, verwijzen wij u naar het protocol B om de bindingsplaatsen alleen om het glaasje (dwz voor TIRF microscopie of SPR) te beperken. Als deze beperking is niet van belang, zie A, maar gebruik gebiotinyleerde conjugaten in stap 4.3 en ga verder met stap 4.8in protocol B om een ​​volledig functionele oppervlak te creëren. Voorafgaand aan het uitvoeren van protocol A en B: Het is raadzaam om alle gebruikte eiwitoplossingen voor het inzetten in de chip filteren. Vuil en eiwitcomplexen kunnen anders cel vallen blokkeren, waardoor het aantal kamers die kunnen worden gebruikt voor analyse verminderen. Hiervoor gebruikt u een nonprotein adsorberende filterinstallatie om alle oplossingen te filteren voordat de introductie ervan in de kanalen. Protocol A (enzymatische assays) <ol><li> Om de microfluïdische apparaat af te ronden, bond de PDMS onderdelen op een glasplaatje. Om dit te doen, eerst te reinigen een glasplaatje met zeep, gedestilleerd water en ethanol. Droog de dia met behulp van een stikstofstroom. Reinig het PDMS deel met plakband. </li><li> Doe de PDMS deel en de gereinigde glazen dia in het plasma reiniger voor 45 sec bij 18 W. Om een ​​strakke binding te verzekeren, zet de chip op een hete plaat (100 ° C) gedurende 5 minuten. </li><li> Na het plakken, vul de chip met fLUID. Een gemakkelijke manier om dit te bereiken is de centrifugale kracht te gebruiken. Snijd het onderste deel van 200 ul pipet tip. Voor de vloeibare kanalen vullen met de blockingbuffer (runderserumalbumine (4% w / v) of poly-L-lysine) geënt polyethyleenglycol (0,05% w / v) en plaats de uiteinden in de inlaten. Vul het besturingslaag inlaten met water of met een oplossing isosmotisch, bijv. PBS. Plaats de chip in de centrifuge (800 xg) gedurende 5 minuten. De kanalen moeten nu worden gevuld met vloeistof volledig. Zo niet, herhaal deze stap. </li><li> Incubeer de blokkerende oplossing gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Was de oplossing van de vloeistoflaag met PBS bij een stroomsnelheid van 10 pl / min met een injectiepomp. Het apparaat is nu klaar voor celexperimenten. </li></ol> Protocol B (immunoassays) Voor een compleet overzicht van de oppervlakte modificatie van stap 4.7 verder wordt verwezen naar Tabel 1. <ol start="5"><li> Incubate PDMS postzegels voor microcontact afdrukken met een BBSA / BSA-oplossing (bijvoorbeeld 1-100). Na 30 min Reinig de stempels grondig met gedestilleerd water en droog het stempel onder een stikstofstroom. Plaats snel de stempels op een gereinigde glasplaatje (figuur 4). </li><li> Expose het glasplaatje met de stempel samen met het bovenste deel van de microfluïdische chip zuurstofplasma gedurende 45 seconden bij maximum vermogen (18 W) in een plasma schoner. Na plasma behandeling, verwijder de stempel en lijn de bedrukte oppervlak onder de microchambers van het apparaat. Plaats de chip gedurende 30 minuten op een hete plaat bij 50 ° C. </li><li> Om de resterende oppervlakte blokkeren, introduceren steriel gefiltreerde BSA-oplossing (4% (w / v) in PBS) in de chip met een centrifuge (zie stap 4.2). Incubeer gedurende 1 uur en was de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS (zie stap 4.3). De chip kan dan rechtstreeks worden toegepast of opgeslagen tot 2 weken bij 4 ° C in een vochtige doos. </li><li> Voor een volledig functionele binding oppere introduceren avidine (0.025% (w / v) in PBS) in het reservoir. Gebruik een stroomsnelheid van 5 pl / min gedurende 30 min naar het avidine oplossing trekken via de fluïdumkanalen. Daarna spoelen PBS gedurende 10 minuten. Spoel het reservoir grondig. </li><li> Daarna voeg Proteïne G (0.0025% (w / v) in PBS) en spoel nog eens 30 minuten. Wassen met PBS gedurende nog 10 minuten daarna. Voeg vervolgens het interessante antilichaam (0,0001% (g / v) in PBS) gedurende 10 minuten. Na 10 min, stop de stroom gedurende 15 minuten om binding mogelijk. Vervolgens wassen met PBS gedurende 10 minuten. </li></ol> 5. Celexperimenten Het protocol is in het algemeen vanwege de verscheidenheid van mogelijke assays. Als voorbeeld wordt de reagentia nodig voor het G6PDH toxiciteit test gegeven. De eerste cel trapping efficiëntie van het apparaat is ongeveer 2,5%, dwz 5 van de 200 cellen zullen worden opgesloten. De definitieve bezetting van de cel vallen sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn, het protocol op te schortende cellijn en het moment dat de cellen worden gespoeld door het kanaal. Voor cellen die van nature groeien in suspensie (bijvoorbeeld U937), kunnen enkele cellen worden gevonden in ongeveer 75% van de kamers na enkele minuten. De andere kamers zijn ofwel niet gevuld of bezet door twee of meer cellen. In het algemeen, de eencellige bezetting is kleiner voor hechtende cellijnen. Bij gebruik van de eerder mild suspendeerfase protocol hier gepresenteerde, het percentage af tot ongeveer 30% (HEK, MLT-cellen). De eencellige bezetting kan worden verbeterd door trypsine behandeling van de cellen, maar dit kan ook de resultaten van de experimenten veranderen. Afhankelijk van het doelmolecuul kan adsorptie of absorptie PDMS de resultaten beïnvloeden. Adsorptie kan worden verminderd door het blokkeren van de oppervlakken met BSA of PLL-g-PEG. Absorptie is het onwaarschijnlijk voor de meeste hydrofiele biomoleculen, maar het moet worden gecontroleerd voor (kleine) lipofiele cel componenten. <ol><li> Bereid de cellen volgens het specifieke protocol (bijv. </em&gt; drugsverslaving). Verende cellen, voeg cellen direct aan de chip. Voor lijm cellijnen gebruiken enzymvrije dissociatie buffer tot een celsuspensie te produceren. Filter de cellen vóór de introductie ervan in de chip om de hoeveelheid celgroepen verminderen. </li><li> Plaats de cellen op de chip met behulp van een injectiepomp en forward flow, in plaats van de celsuspensie trekken. Gebruik een stroomsnelheid van 5 ul / min voor suspensie cellijnen en hogere stroomsnelheden van 10-20 pl / min voor lijm cellen aangezien niet-specifieke hechting van de cellen te verminderen op de kanaalwanden. </li><li> Wanneer de vallen gevuld, sluit de kamers. Als veel cellen hechten niet-specifiek aan het oppervlak, proberen ze weg te wassen met celdissociatiebuffer met een stroomsnelheid van 10-30 pl / min. </li></ol> Protocol A (enzymatische assays) <ol start="4"><li> Trekken lysebuffer door de chip. Voor dit voorbeeld, deze buffer is een hypoosmolar buffer toegevoegd Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1% (v / v) Tween 20). Voor lysis, snel open en dicht kamers (dwz 500 msec voor debieten van 10-50 pl / min 7,21). Voor de bepaling G6PDH, voeg 2 mM glucose-6-fosfaat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml diaforase en 0,3 mM resazurin de lysisbuffer. Beginnen met het monitoren van de kinetische reactie direct na lysis. </li></ol> Opmerking: Kies een buffer die geschikt is voor de test, maar kaal in het achterhoofd dat sterke reinigingsmiddelen (zoals Triton, SDS) Lyse cellen onmiddellijk en zal leiden tot een verlies van analyt tijdens kamer opening. Protocol B (immunoassays) Voor een korte beschrijving van de ELISA celexperimenten (debieten, kamer-status, etc.) wordt verwezen naar Tabel 1. <ol start="5"><li> Voor ELISA, voegt de gewenste detectie reagens (bijv. secundair antilichaam, gemerkt antigeen) rechtstreeks aan de lysisbuffer. De hierin toegevoegde Tween 20 vermindert de niet-specifieke adsorptie. Lyseren van de cellen volgens stap 5.4. Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten binding (incubatietijd afhankelijk van het gebruikte antigeen en antilichaam) mogelijk. </li><li> Antilichaam enzym conjugaten die niet-specifiek geadsorbeerde de kanaalwanden kan leiden tot een omzetting van de detectiereagens reeds in het reservoir en kanalen. Om problemen te verminderen van deze adsorptie, spoelen een permanente remmer van de gebruikte detectie enzym via de chip tijdens de incubatietijd (kamers gesloten, voordat u de detectiereagens). Voor de HRP, gebruiken 20 mM HCl in water om het niet-specifiek geadsorbeerd enzymen permanent te inactiveren. </li><li> Na incubatietijd introduceren detectie reagens (bijv. Amplex Red en waterstofperoxide voor HRP) aan de chip. Open de kamers binnenkort weer te wassen van de niet-gebonden secundair antilichaam weg en de detectie reagens toe te voegen. Beginnen met het monitoren van de kinetische reactie onmiddellijk. </li><li> Kalibratie: Immobiliserenhet antilichaam tegen het doelwit van belang. Sluiten kamers. Bereid verschillende concentraties van de stof in buffer of in cellysaat off-chip. Breng een concentratie naar de chip en snel wisselen van het volume in de kamers (500 msec openingstijd). Deze opening is voldoende kort om te voorkomen dat extra ophoping van analyt spoelen slechts een bepaald aantal moleculen van het volume van de microkamer gedetecteerd. Van de bekende concentratie van het antigeen in de oplossing en het volume van de kamer (625 pl) Bereken de hoeveelheid binnen de kamer. Daarna verder met stap 5.5 en de invoering van de detectie-eenheid. </li></ol>

<ol><li>Walling, M. A., Shepard, J. R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+heterogeneity+and+live+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular heterogeneity and live cell arrays.</a> Chem. Soc. Rev. 40 (7), 4049-4076 (2011).</li>
<li>Schmid, A., Kortmann, H., Dittrich, P. S., Blank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+single+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological single cell analysis.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20 (1), 12-20 (2010).</li>
<li>Lecault, V., White, A. K., Singhal, A., Hansen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+single+cell+analysis%3A+from+promise+to+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic single cell analysis: from promise to practice.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16 (3-4), 381-390 (2012).</li>
<li>Faley, S., Seale, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+platform+for+real-time+signaling+analysis+of+multiple+single+T+cells+in+parallel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic platform for real-time signaling analysis of multiple single T cells in parallel.</a> Lab Chip. 8 (10), 1700-1712 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Di Carlo, D., Aghdam, N., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+enzyme+concentrations%2C+kinetics%2C+and+inhibition+analysis+using+high-density+hydrodynamic+cell+isolation+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Single-cell enzyme concentrations, kinetics, and inhibition analysis using high-density hydrodynamic cell isolation arrays.</a> Anal. Chem. 78 (15), 4925-4930 (2006).</li>
<li>Cecala, C., Rubakhin, S. S., Mitchell, J. W., Gillette, M. U., Sweedler, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyphenated+optical+trap+capillary+electrophoresis+laser+induced+native+fluorescence+system+for+single-cell+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A hyphenated optical trap capillary electrophoresis laser induced native fluorescence system for single-cell chemical analysis.</a> Analyst. 137 (13), 2965-2972 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Kuhn, P., Hanke, C., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchamber+array+for+single+cell+isolation+and+analysis+of+intracellular+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microchamber array for single cell isolation and analysis of intracellular biomolecules.</a> Lab Chip. 12 (4), 765-772 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Ma, C., Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat. Methods. 17 (6), 738-743 (2011).</li>
<li>Shi, Q., Qin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 419-424 (2012).</li>
<li>Powell, A. A., Talasaz, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+profiling+of+circulating+tumor+cells%3A+transcriptional+heterogeneity+and+diversity+from+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines.</a> PLoS ONE. 7 (5), e33788(2012).</li>
<li>Martin-Belmonte, F., Perez-Moreno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+polarity%2C+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell polarity, stem cells and cancer.</a> Nature. 12 (1), 23-38 (2012).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li>
<li>Gao, Y., Majumdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+valve-enabled+microfluidic+cell+co-culture+platform+and+demonstration+of+its+applications+to+neurobiology+and+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A versatile valve-enabled microfluidic cell co-culture platform and demonstration of its applications to neurobiology and cancer biology.</a> Biomed. Microdevices. 13 (3), 539-548 (2011).</li>
<li>White, A. K., VanInsberghe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+RT-qPCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 13999-14004 (2011).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7437), 337-342 (2011).</li>
<li>Kortmann, H., Kurth, F., Blank, L. M., Dittrich, P. S., Schmid, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+real+time+analysis+of+protein+secretion+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards real time analysis of protein secretion from single cells.</a> Lab Chip. 9 (21), 3047-3049 (2009).</li>
<li>Huang, Y., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Anal. Chem. 83 (12), 4393-4406 (2011).</li>
<li>Huang, N. T., Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+platform+for+in+situ+cellular+cytokine+secretion+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic platform for in situ cellular cytokine secretion immunophenotyping.</a> Lab Chip. 12 (20), 4093-4101 (2012).</li>
<li>Eyer, K., Stratz, S., Kuhn, P., Küster, S. K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+enzyme-linked+immunosorbent+assays+on+a+microfluidic+chip+to+quantify+intracellular+molecules+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Implementing enzyme-linked immunosorbent assays on a microfluidic chip to quantify intracellular molecules in single cells.</a> Anal. Chem. 85 (6), 3280-3287 Forthcoming.</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc.+Tech%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> J. Electron Microsc. Tech. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Pandolfi, P. P., Sonati, F., Rivi, R., Mason, P., Grosveld, F., Luzzatto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+housekeeping+gene+encoding+glucose+6-phosphate+dehydrogenase+%28G6PD%29%3A+G6PD+is+dispensable+for+pentose+synthesis+but+essential+for+defense+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the housekeeping gene encoding glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD): G6PD is dispensable for pentose synthesis but essential for defense against oxidative stress.</a> EMBO J. 14 (21), 5209-5215 (1995).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Microfluidics technologie heeft nieuwe en fascinerende mogelijkheden voor single-cell analyse. In het bijzonder, heeft de mogelijkheid te vangen en te immobiliseren cellen individueel microfluïdische gereedschappen toegestaan ​​systematische korte en lange-termijn studies over eencellige eigenschappen en de respons. Bovendien inkapselen van cellen in hoogfrequente microdruppeltjes, gegenereerd op een microchip heeft enkele cel secretie studies, die niet kan worden uitgevoerd met gebruikelijke cytometrie inrichtingen ing...

Vele studies in het verleden cel tot cel verschillen binnen een grote celpopulatie 1-3, in het bijzonder signalering verwerkt 4 of de hoeveelheden intracellulaire biomoleculen zoals eiwitten 5,6, metabolieten en cofactoren 7,8 geopenbaard. Deze heterogeniteit wordt geacht fundamenteel belang voor de aanpassing en evolutie 9 cellen toe, maar spelen ook een belangrijke rol bij het ​​ontstaan ​​en behandeling van ziekten zoals kanker 10-13. Daarom studies over de eencellige niveau van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek, vooral als deze studies tonen de verschillende celreacties na behandeling met bioactieve chemicaliën. De laatste jaren zijn veel analytische platforms ontwikkeld die de analyse van afzonderlijke levende cellen of de chemische samenstelling van de celinhoud vergemakkelijken. Terwijl fluorescent geactiveerde cel sortering (FACS) is de gouden stAndard voor hoge-doorvoer analyse van afzonderlijke levende cellen, de methode niet worden toegepast voor de kwantificering van intracellulaire of uitgescheiden verbindingen. De opkomst van microfluïdische platforms heeft nieuwe analytische strategieën voor de positionering, de behandeling en observatie van enkele cellen beloofd. Een mijlpaal in microfluidics werd bereikt met de integratie van flexibele PDMS kleppen gerealiseerd door Quake en collega&#39;s 14,15. Deze kleppen zijn nuttig omdat ze regio&#39;s kunnen isoleren op chip, bijv. scheiden twee culturen 16. Bovendien zijn ze bijzonder toepasbaar voor single cell analyse en daarom bijdragen aan analyt verdunning te verminderen. De kracht van deze aanpak voor single-cell analyse is onlangs aangetoond door Hansen en collega&#39;s, die de genexpressie geanalyseerd uit honderden individuele cellen in parallel 17. Bij targeting eiwitten en metabolieten, de analyse moeilijk door het ontbreken van een geschiktemplification methoden, het grote aantal verschillende verbindingen aanwezig zijn, en de verschillen in chemische aard. Bovendien zijn de meeste intracellulaire biomoleculen verwacht aanwezig in lage kopie-aantallen in de orde van enkele tienduizenden 18 te zijn, vandaar de gebruikte analysemethode moet een hoge gevoeligheid hebben. Krachtiger testen zoals immunoassays en enzym-linked immunoassays (ELISA) zijn moeilijk te integreren in microfluïdische apparaten omdat ze vereisen een aantal wassen en incubatie stappen evenals oppervlak immobilisatie. Als gevolg van deze uitdagingen, is het niet verwonderlijk dat slechts een paar voorbeelden zijn gemeld waar eiwitten of metabolieten werden gekwantificeerd op de single-cell niveau. Zo hebben studies naar de uitscheiding van fluorescerende verbindingen gemeld 19,20. Onlangs heeft de uitvoering met ELISA werd voor de analyse van uitgescheiden (niet-fluorescerende) eiwitten van een celkweek (THP-1-cellen) 21 en single (immune) cellen 10. Targeting intracellulaire eiwitten, Shi et al.. Ontwikkelde een microfluïdische apparaat dat de identificatie van intracellulaire eiwitten voor de analyse van signaal transductie in tumorcellen door middel van een immunoassay 11 vergemakkelijkt. Slechts relatieve hoeveelheden eiwitten werden bepaald en geen enzymatische amplificatie werd gebruikt om het signaal voor lage abundantie proteïnen verhogen. Onlangs waren we in staat om een single-cell trapping microdevice met fluorescentie-assays 8 en immunoassays 22 (figuur 1) te combineren. Cellen worden passief gevangen in microsized hindernis structuren, die het aanbod en (snelle) uitwisseling van middelgrote en andere chemische middelen zonder enige beweging van de cellen mogelijk te maken. Een ringvormige klep rond elke val maakt isolatie van de cel in een zeer klein volume (&quot;de microkamer&quot;). Deze klep wordt geactiveerd direct na de invoering van een cel-lyseren (hypoosmolar) buffer, hijNVU voorkomen intracellulaire moleculen of uitgescheiden moleculen weg te diffunderen. Het belangrijkste is, vanwege de kleine grootte van het volume (625 pl) grote verdunning van de moleculen wordt vermeden. Aangezien lysis en analyse uitgevoerd op dezelfde positie in de chip, is er geen verlies van analyten door transport. Het ontwerp van de chip hier beschreven bestaat uit 8 afwisselend rijen van 7 of 8 microchambers, in totaal 60 microchambers. De kamers worden bediend in rijen, zodat kruisbesmetting langs een lijn is uitgesloten. Het platform kan gebruikt worden in combinatie met fluorescentie assays en immunologische assays (figuur 1d). Voor deze laatste, hebben we protocollen voor immobilisatie van de antilichamen, die met de chip productie en assemblage proces. Vandaar het platform opent de weg voor de gevoelige, betrouwbare en kwantificeerbare assays op de enkele cel niveau. Tot nu toe hebben we de inrichting voor de analyse van intracellular en uitgescheiden enzymen (relatieve kwantificatie door enzymatische assays), intracellulaire cofactoren, eiwitten en kleine moleculen (absolute kwantificatie door eindpunt assays of ELISA). Hieronder beschrijven we de werkwijze chip fabricage door middel van zachte meerlaagslithografie en protocollen voor patroonvorming van de antilichamen via microcontact printen en oppervlaktechemie. Daarnaast is een aantal voorbeelden van de chip gebruik en behandelingen worden gegeven.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naam van het reagens</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen (optioneel)</td></tr><tr><td>SU-8 2015</td><td>MicroChem Corp. (Netwon, MA)</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silaan</td><td>ABCR (Karlsruhe, Duitsland)</td><td>AB103608</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta;-D-N,N&prime;-diacetylchitobioside hydraat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9763</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Duitsland)</td><td>100014</td><td></td></tr><tr><td>Avidine</td><td>AppliChem (Axon Lab AG)</td><td>A-2568</td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Duitsland)</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>AZ 726 ontwikkelaar</td><td>AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Duitsland)</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine, biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-8549</td><td></td></tr><tr><td>Celldissociatiebuffer</td><td>Invitrogen</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Hexamethyldisilazaan (HDMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40215</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Fluka</td><td>84422</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck VWR (Darmstadt, Duitsland)</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MR developer 600</td><td>Microresist technology GmbH (Berlijn, Duitsland)</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG gegraft</td><td>SuSoS, (D&uuml;bendorf, Zwitserland)</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG gegraft biotin</td><td>SuSoS, (D&uuml;bendorf, Zwitserland)</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fluka</td><td>60132</td><td></td></tr><tr><td>Proteïne G, biotin</td><td>Sigma Fine Chemicals</td><td>41624</td><td></td></tr><tr><td>Siliciumwafer</td><td>Si-Mat (Kaufering, Duitsland)</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>39100000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan</td><td>Biorad</td><td>1610716</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biorad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td>APPARATUUR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiaalnaam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen (optioneel)</td></tr><tr><td>0,22 &micro;m PES spuitfilter</td><td>TRP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>1/1,5 mm biopsie puncher</td><td>Miltex, York PA</td><td>33-31AA/33-31A</td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics filter 20 &micro;m</td><td>Partec</td><td>04-004-2325</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sigma 3-18K</td><td>Kuehner</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate HP 160 III BM</td><td>Sawatec, Sax, Zwitserland</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>MA-6 mask aligner</td><td>Karl Suess</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Multizoom AZ100M microscoop</td><td>Nikon Corporation</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Fotomasker</td><td>Microlitho, Essex, U.K.</td><td>n.v.t</td><td></td></tr><tr><td>Plasma Cleaner PDC-32G</td><td>Harrick</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE</td><td>Laurell</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Spin Modules SM 180 BM</td><td>Sawatec, Sax, Zwitserland</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Step profiler Dektak XT Advanced</td><td>Bruker</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr><tr><td>Spuitpomp neMESYS</td><td>Cetoni</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

een microfluïdische chip voor de versatile chemische analyse van enkele cellen

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

Wij presenteren een microfluïdische apparaat dat de kwantitatieve bepaling van intracellulaire biomoleculen in meerdere afzonderlijke cellen parallel maakt. Hiertoe worden de cellen passief gevangen in het midden van een microkamer. Na activering van de besturingslaag wordt de cel geïsoleerd van de omringende volume in een kleine kamer. De omliggende volume kan dan worden uitgewisseld zonder dat de geïsoleerde cel. Echter, bij korte openen en sluiten van de kamer, de oplossing in de kamer kan worden vervangen binnen een paar honderd milliseconden. Door de omkeerbaarheid van de kamers kunnen de cellen worden blootgesteld aan verschillende oplossingen achtereenvolgens een zeer controleerbare wijze, bijv. voor incubatie, wassen en tenslotte cellysis. De goed afgesloten microchambers staat het behoud van het lysaat, minimaliseren en de controle van de verdunning na cellysis. Aangezien lysis en analyse plaatsvinden op dezelfde locatie, is hoge gevoeligheid behouden omdat geen verdere dilution of verlies van de analyten optreedt tijdens het transport. De microkamer ontwerp maakt daarom de betrouwbare en reproduceerbare analyse van zeer kleine kopie-aantallen van intracellulaire moleculen (attomol, zeptomol) vrijgelaten uit individuele cellen. Bovendien kunnen vele microchambers worden opgesteld in een matrix format, waarbij de analyse van vele cellen tegelijk, aangezien geschikte optische instrumenten worden gebruikt voor bewaking. We hebben al gebruik van het platform voor proof-of-concept studies naar intracellulaire eiwitten, enzymen, co-factoren en second messengers in zowel relatieve of absolute meetbare wijze te analyseren.

Het platform kan een aantal intracellulaire en afgescheiden moleculen in of geproduceerd door enkele cellen te analyseren. Hier willen we ander voorbeeld studies aan de verscheidenheid van mogelijke tests onderstrepen. We zullen een voorbeeld voor een uitgescheiden enzym (figuur 5a) en een intracellulair enzym (figuur 5b) en eiwit (Figuren 5c en d). Voor meer voorbeelden, zoals co-factoren of kleine moleculen, verwijzen wij u naar Eyer et al.. ...

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om lysaten van enkelvoudige cellen te analyseren met behulp van fluorescentie- of immunoassays. Dit wordt bereikt door eerst een microfluïdisch apparaat te maken en de binnenkamer te coaten met antilichamen. Vervolgens worden enkelvoudige cellen in de traps geïmmobiliseerd en worden ze in een tweede stap blootgesteld aan diverse reagentia om een cellulaire respons te stimuleren.Een ringvormig klepje wordt snel gesloten en lysisbuffer wordt door het device gestuurd. Het ringvormige klepje wordt kortstondig geopend, waardoor de cellen in de microkamerlyseren en de vrijgekomen eiwitten door het kleine volume in een hoge concentratie kunnen binden aan de antilichamen. Vervolgens wordt het ringvormige klepje geopend.De kamer wordt gewassen en detectiereagentia worden in de gesloten microkamer gebracht. De toename van de fluorescentie-intensiteit wordt in de tijd gemonitord met een fluorescentiemicroscoop; de resultaten tonen de mogelijkheid van dit systeem om een analyte van belang die door individuele cellen wordt vrijgegeven, kwantitatief en betrouwbaar te detecteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van analyse van individuele cellen.In het bijzonder richtte het zich op systematische onderzoeken naar de cellulaire respons op variaties in de chemische omgeving. We kunnen op- of neerreguleringen van intracellulaire moleculen waarnemen als gevolg van de chemische stimulus. Deze techniek biedt twee belangrijke voordelen.Ten eerste kunnen we de geïmmobiliseerde cellen blootstellen aan een gedefinieerde chemische omgeving die constant is of periodiek verandert. Ten tweede kunnen we zeer gevoelige en specifieke analyses van de toestand uitvoeren zonder kruiscontaminatie of verlies van analyten door transport. Begin met het vervaardigen van de drie verschillende SU-8 masterwafers zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Eén wordt gebruikt voor het creëren van de vloeistoflaag, één voor de controllaag en een derde voor de microcontactstempel. Fabriceer vervolgens de microfluïdische chips, beginnend met de bereiding van een mengsel van PDMS en een uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1. Meng beide componenten krachtig en ontgas de oplossing gedurende 30 minuten of totdat het mengsel bubbelvrij is.Plaats vervolgens de wafer met de controllaag laags in een Petrischaal en plak deze op de bodem. Giet ongeveer 50 gram PDMS erbovenop om een laag van vier tot vijf millimeter dik te creëren en plaats de wafer gedurende ten minste twee uur in een oven bij 80 °C om volledige uitharding van het PDMS te garanderen. Herhaal dezelfde procedure voor de wafer voor microcontactprinten, maar gebruik ongeveer 20 gram PDMS in plaats van 50, wat resulteert in een PDMS-laag van vier tot vijf millimeter dik.Om de onderste laag voor te bereiden, wordt een 40 micron dikke PDMS-laag op de wafer met de microfluïdische laag gespint. Gebruik hiervoor een rotatiesnelheid van 2000 RPM gedurende 60 seconden. Hard het PDMS-laag uit in een oven gedurende één uur bij 80 °C wanneer alle onderdelen zijn uitgehard.Verwijder de controllaag van de wafer en snijd deze in stukken met behulp van een scheermesje. Maak vervolgens drukverbindingsgaten met een biopsiepons van één millimeter en plak de kanalen met tape af voor opslag. Verwijder daarna de PDMS van de wafer voor microcontactprinten en bereid stempels voor die dezelfde afmetingen hebben als het kamergebied.Bewaar ze stofvrij in een lade tot gebruik. Plaats vervolgens de spin-gecoate wafer en de vier tot vijf millimeter dikke controllaag in een plasmareiniger. Stel de stukken bloot aan zuurstofplasma bij 0,75 millibar gedurende 45 seconden bij 18 watt.Lijn na de plasmabehandeling beide lagen snel uit onder een microscoop met een grote werkafstand. Voeg wat extra PDMS toe rondom de geplaatste bovenstukken om het verwijderen van de PDMS van de wafer te vergemakkelijken. Plaats de wafer vervolgens gedurende ten minste één uur in een oven bij 80 °C.Zodra het is uitgehard, gebruik dan een scalpel om het PDMS voorzichtig van de wafer te verwijderen en om de microchips uit te snijden. Pons toegangsgaten voor de vloeistofverbindingen met een biopsiepons van 1,5 millimeter. Maak daarnaast een reservoir in de microchip door het bovenste gedeelte van een pipetpunt van 200 µL af te snijden en wat overgebleven half-uitgehard PDMS te gebruiken. Plak dit aan de bovenkant.Hard vervolgens de chip uit in de oven bij 80 °C gedurende ten minste één uur. Begin met het reinigen van een glazen objectglas en de PDMS-onderdelen. Reinig een glazen objectglas met zeep.Spoel het objectglas af met gedestilleerd water en vervolgens opnieuw met ethanol. Droog het objectglas met een stroom stikstof. Gebruik plakband om eventuele resten en stofdeeltjes van de PDMS te verwijderen.Plaats vervolgens het PDMS-onderdeel en het gereinigde glas. Schuif deze voor 45 seconden bij 18 watt in de plasmareiniger om een stevige hechting te garanderen, en plaats de chip na de plasmabehandeling vijf minuten op een warmteplaat. Snijd na het hechten het onderste gedeelte van een paar 200 µL pipetpunten af. Vul deze met 10 tot 15 µL gefilterde PBS met 4% BSA en plaats ze in de inlaatopeningen van het apparaat.Gebruik vervolgens afgesneden tips met 10 tot 15 µL PBS en plaats deze in de controlekanalen. Plaats de chips daarna in de centrifuge en centrifugeer ze 5 minuten bij 800 ×g om de kanalen met vloeistof te vullen. Als er lucht in een van de kanalen achterblijft, herhaal deze stap dan totdat de kanalen volledig zijn gevuld.Incubeer de blokkeringsoplossing gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS bij een stroomsnelheid van 10 µL per minuut. Met behulp van een spuitenpomp is het apparaat nu klaar voor cel-experimenten om de glazen objectglas voor immunoassays voor te printen; incubeer PDMS microcontactprintstempels met 0,5% gebiotineerd BSA in een schone Petrischaal.Reinig de stempels na een half uur grondig en snel met gedestilleerd water en droog de stempel onder een stroom stikstof. Plaats de stempels, zodra ze droog zijn, snel op een gereinigde glazen objectglas om het gepatronde gebiotinyleerde BSA te deponeren. Verplaats de stempel niet na het plaatsen en controleer of de stempel in contact staat met het glazen objectglas.Tik, indien nodig, lichtjes tegen de stempel, maar druk niet hard aan. Plaats vervolgens de stempel samen met het bovenste gedeelte van de microfluïdische chip in de plasmakamer en stel ze 45 seconden lang bloot aan zuurstofplasma bij 18 watt. Verwijder na de plasmabehandeling de stempel van het glasplaatje.Door op het oppervlak te ademen, wordt het patroon zichtbaar. Lijn de microkamers uit bovenop het geprinte oppervlak. Zodra deze zijn uitgelijnd, plaatst u de chip gedurende 30 minuten op een warmteplaat bij 50 °C om het overige oppervlak te blokkeren, brengt u met een centrifuge een 4% steriel gefilterde BSA-oplossing in PBS in de chip aan zoals eerder beschreven, incubeert u de microchip gedurende ten minste 30 minuten en spoelt u vervolgens de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS bij een stroomsnelheid van 10 µL per minuut.Gebruik de chip met een spuitenpomp, direct na productie of bewaard tot twee weken bij vier graden celsius in een bevochtigde box. Creëer vervolgens een volledig functioneel bindend oppervlak door avadon in PBS in het reservoir aan te brengen. Laat de oplossing stromen om de avadon vervolgens door de vloeistofkanalen te trekken.Spoel het reservoir grondig uit en spoel de kanalen door met PBS. Voeg vervolgens proteïne G toe aan het reservoir en trek dit door de kanalen. Was eventueel overtollige proteïne G weg door het reservoir en de chip te spoelen met PBS.Voeg vervolgens het antilichaam van belang toe aan het reservoir en laat het door de kanalen stromen. Stop daarna de stroom om binding mogelijk te maken voordat de kanalen met PBS worden gewassen; fluorescentie-gelabelde analogen kunnen worden gebruikt om de kwaliteit van het printproces te controleren voordat er cellen in de kanalen worden geïntroduceerd. Oogst aanhechtende cellen, zoals de hier getoonde HE 2 9 3 cellen, met behulp van een enzymvrije dissociatiebuffer en filter deze vervolgens om het aantal celclusters te verminderen. Laad ze na het filteren in een spuit.Laad de cellen op de chip bij een concentratie van 300 000 cellen per milliliter door de spuitpomp ongeveer drie minuten lang in voorwaartse richting te laten stromen met een snelheid van 10 tot 20 µL per minuut. Voor adhesieve cellen zoals deze is dit nodig om aspecifieke aanhechting van de cellen te voorkomen wanneer de vallen gevuld zijn. Sluit vervolgens de kamers door de bovenlaag onder een druk van drie bar te zetten. Inspecteer daarna de kamers met een microscoop. Als blijkt dat veel cellen aspecifiek aan het oppervlak binnen de kamers zijn gehecht, open deze dan snel en probeer ze weg te spoelen met een celdissociatiebuffer bij een stroomsnelheid van 10 tot 30 µL per minuut.Voeg voor de glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PDH)-assay 2 mM glucose-6-fosfaat, 0,5 U/mL NADP en 0,3 mM RIN toe aan een lysisbuffer en zorg dat dit goed is gemengd. Zodra de kanalen zijn vrijgemaakt, wordt de G6PDH-lysisbuffer met een stroomsnelheid van 30 µL/min door de chip getrokken. Terwijl de lysisbuffer stroomt, worden de kamers snel geopend en gesloten, waarbij ze 500 ms open blijven zodat de lysisbuffer de kamer kan binnendringen; begin onmiddellijk na de lysis met het monitoren van de kinetische reactie.In dit voorbeeld kan een fluorescent product in de tijd worden gemonitord. Hier wordt een reeks kamers getoond die zijn gevuld met oranje voedingskleurstof en vervolgens zijn afgesloten door de controllaag boven de microkamers onder druk te zetten. Na het sluiten van de kamers is groene voedingskleurstof door de kanalen gespoeld om de dichtheid van de kamers aan te tonen.Elke kamer bevat een volume van slechts 625 picoliters vloeistof, waardoor de concentratie van moleculen die door de lys-cellen worden afgegeven, hoog genoeg blijft voor analyse. Bovendien kunnen de kleppen zodanig worden geopend en gesloten dat kruiscontaminatie tussen de kamers wordt voorkomen. Binnen deze kamers is het mogelijk om analyten te meten, zoals de hoeveelheid lysosoom die door een enkele PMA-geactiveerde U 9 37-cel wordt afgegeven, aangezien dit enzymatisch de productie van een fluorescent molecuul binnen de kamer katalyseert.De groene lijnen representeren de verandering in fluorescentie-intensiteit over de tijd voor kamers die door één cel worden bezet. Ook is de fluorescentie-intensiteit voor een kamer zonder cellen weergegeven door de zwarte stippellijn. Ter vergelijking laat deze assay het effect van een toxisch molecuul op de membraanintegriteit zien door een intracellulair enzym, G6PDH, te meten.De zwarte lijn stelt de controlemonsters zonder toxische invloed voor, terwijl de oranje lijn cellen representeert die beïnvloed zijn door het getoonde toxine. Hier is een voorbeeld van een immunoassay voor het intracellulaire eiwit. GFP anti-GFP-antilichamen werden op het oppervlak geïmmobiliseerd en zodra de cellen waren gelyseerd, werden de bindingskinetiek van de GFP-eiwitten gevisualiseerd met behulp van turf-microscopie.Tijdstip 0,1 markeert de toevoeging van de lysisbuffer; op tijdstip 0,2 begint GFP zich op het oppervlak te ophopen, wat betekent dat cellysis heeft plaatsgevonden en GFP naar het oppervlak is gediffundeerd. De binding van GFP aan de antilichamen is voltooid op tijdstip 0,3. In dit laatste voorbeeld is vrijgekomen GA DH gebonden aan capture-antilichamen op het oppervlak, waarna HRP-gekoppelde detectie-antilichamen zijn toegevoegd.Zodra alle niet-gebonden detectieantilichamen waren weggewassen, werd het detectiereagens toegevoegd en werd de reactie in de tijd gevolgd. Hier volgt een vergelijking van de hoeveelheid voorheen intracellulaire GA DH in dierlijke hoeveelheden tussen U 9 37 en HEC 2 93 cellen, gemeten met deze methode. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de microfluïdische chips voorbereidt, hoe u het oppervlak modificeert om immunoassays mogelijk te maken en tot slot hoe u het apparaat gebruikt voor analyse van enkele cellen.Deze methode kan worden ingezet om te helpen bij het beantwoorden van vele prangende vragen op het gebied van de single-cell biologie.

a-microfluidic-chip-for-versatile-chemical-analysis-single

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Druppel op basis van microfluïdische platforms zijn veelbelovende kandidaten voor high throughput experimenten, omdat zij in staat zijn om goedkoop te genereren picoliter, self-gecompartimenteerde schepen op kHz tarieven. Door integratie met snelle, gevoelige en een hoge resolutie fluorescentie spectroscopische methoden, kunnen de grote hoeveelheden informatie uit die in deze systemen efficiënt kunnen worden geëxtraheerd, aangewend en gebruikt.

Fluorescentie detectiemethoden voor microfluïdische druppel platforms

Millifluidic apparaten worden gebruikt voor gecontroleerde synthese van nanomaterialen tijdsopgeloste analyse van reactiemechanismen als continu katalyse.

Millifluidics voor chemische synthese en Tijdopgeloste mechanistische studies

We presenteren een microfluidic gebaseerde elektrochemische biochip voor DNA hybridisatie detectie. Na ssDNA probe functionalisering, de specificiteit, gevoeligheid en detectielimiet bestudeerd met complementaire en niet complementaire ssDNA targets. De resultaten tonen de invloed van de DNA hybridisatie aan het elektrochemische systeem, met een detectielimiet van 3,8 nM.

A-Microfluidic gebaseerd Elektrochemische Biochip voor-Label vrij DNA hybridisatie-analyse

We presenteren een discrete druppel monster introductie voor inductief gekoppeld plasma massaspectrometrie (ICPMS). Het is gebaseerd op een goedkope en wegwerpbare microfluïdische chip die sterk monodisperse druppeltjes in een groottebereik van 40-60 pm bij frequenties van 90 tot 7000 Hz.

Een Microfluïdische Chip voor ICPMS Sample Inleiding

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en kweken van enkele cellen met een microfluïdische platform, dat een nieuw microwell-ontwerpconcept gebruikt om hoogwaardige isolatie van enkele cellen en langdurige klonale kweek mogelijk te maken.

Een microfluïdische platform voor High-throughput Single-cell Isolatie en Cultuur

Micro-gefabriceerde apparaten geïntegreerd met vloeistofcomponenten bieden een in vitro platform voor celstudies die het in vivo micro-milieu nabootsen. We ontwikkelden op polymethylmethacrylaat gebaseerde microfluïdische chips voor het bestuderen van cellulaire reacties onder enkele of naast elkaar bestaande chemische/elektrische/schuifspanningsstimuli.

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

We tonen een microfluïdische platform met een geïntegreerde oppervlakte-elektrode netwerk resistieve pulse sensing (RPS) met code division multiple access (CDMA) combineert, om detectie en afmeting van deeltjes in meerdere microkanalen multiplexen.

Microfluïdische Platform met multiplexverzending elektronische detectie voor ruimtelijke Tracking van Deeltjes

Hier presenteren we adresseerbare druppel microarrays (ADMs), een druppel array gebaseerde methode kunnen bepalen van absolute eiwit overvloed in afzonderlijke cellen. We laten de mogelijkheid van ADMs te karakteriseren de heterogeniteit in de expressie van de tumor suppressor eiwit p53 in een menselijke kanker cellijn zien.

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.

Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip

We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Het protocol beschrijft een geavanceerd microfluïdisch platform om de cytokinesecretiedynamiek van individuele menselijke perifere mononucleaire bloedcellen kwantitatief te meten. Het platform meet tot drie cytokines parallel (IL-6, TNFα en IL-1β) voor elke individuele cel die wordt gestimuleerd met lipopolysaccharide als voorbeeld.

Microfluïdische benadering om gelijktijdige en sequentiële cytokinesecretie van individuele polyfunctionele cellen op te lossen 

Leer een microfluïdische chip voor enkele celanalyse met fluorescentie- en immunoassays. Deze methode kwantificeert intracellulaire eiwitten en enzymen met hoge precisie en specifiteit.

Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Meer video's verkennen