Genotypering van muizen

Genotypering is het proces waarbij de aanwezigheid, of afwezigheid, van specifieke DNA-sequenties in het genoom van een bepaald organisme wordt vastgesteld.

Aangezien genen het fenotype van een muis kunnen beïnvloeden, is het essentieel om de genetische samenstelling, of het "genotype", van een individuele muis te kunnen bepalen om een fenotype aan een specifiek gen toe te schrijven. In deze video worden de genetica van muizen verkend, de belangrijkste stappen van de genotyperingsprocedure gedemonstreerd en wordt uitgelegd hoe PCR-gebaseerde genotyperingsresultaten geïnterpreteerd moeten worden.

Om te begrijpen waar onderzoekers naar zoeken bij het genotyperen van muizen, bekijken we enkele veelvoorkomende manipulaties van de muizengenetica.

Om een gen te bestuderen, verstoren wetenschappers vaak de functie ervan door de genetische sequentie te wijzigen. Aangezien muizen echter diploïde zijn, hebben ze twee kopieën van elk gegeven gen. Omdat de meeste genen slechts één normale kopie nodig hebben om te functioneren, moeten de muizen worden gefokt om een dier te produceren waarbij beide genen zijn verstoord voordat het fenotype kan worden bestudeerd.

Dit genotype wordt een "homozygoote knockout" genoemd, of vaker afgekort als "knockout". Omgekeerd wordt een normale muis met twee functionele kopieën een "homozygoot wildtype" of simpelweg "wildtype" genoemd. Ten slotte worden muizen met slechts één functionele kopie aangeduid als "heterozygoot" of "hets".

In plaats van genetisch materiaal te verwijderen, vereisen sommige experimenten de introductie van DNA-sequenties in het genoom van de muis. Deze ingevoegde DNA-fragmenten worden "transgenen" genoemd, en de muizen die deze dragen zijn "transgeen". Het meest voorkomende "transgeen" dat in muizen wordt geïntroduceerd, is een transgeen dat de expressie stimuleert van het groen fluorescerende eiwit, of GFP, afkomstig van kwallen. Door een weefselspecifieke promotor (een regulerende sequentie die de activiteit van een gen "promoot") te gebruiken om de GFP-productie aan te sturen, kunnen cellen van een specifiek weefseltype eenvoudig worden geïdentificeerd aan de hand van groene fluorescentie.

Omdat veel genetische veranderingen niet leiden tot een direct waarneembaar fenotype, zoals GFP-expressie, moeten muizen worden geg genotypeerd om te bepalen welk specifiek dier in experimenten moet worden gebruikt. Voorafgaand aan het genotyperen moeten de muizen zorgvuldig worden gemarkeerd, zodat ze later opnieuw kunnen worden geïdentificeerd. Nee, u heeft iets permanenters nodig dan dat. Een gebruikelijke methode is het maken van inkepingen in het oor, waarbij de positie en het aantal inkepingen corresponderen met een identificatienummer.

Zodra de muis is gemarkeerd, neemt u een klein stukje weefsel af (doorgaans 2 — 5 mm van de staart, met een scheermesje of schaar) waaruit DNA kan worden geëxtraheerd. Als u weefsel van meer dan één muis afneemt, markeert u de gebruikte segmenten van het mesje om er zeker van te zijn dat u hetzelfde deel niet bij het volgende dier gebruikt, wat zou kunnen leiden tot kruiscontaminatie van uw monsters.

Om het proces van het scheiden van het genetisch materiaal van andere componenten van het weefsel te starten, wordt het monster gedigesteerd in lysisbuffer die het enzym proteinase K bevat. Na een nachtelijke digestie wordt het monster gecentrifugeerd om haar en ander onverteerd materiaal te pelletteren. Om DNA uit het gedigesteerde lysaat te isoleren, is een eenvoudige en effectieve methode het toevoegen van alcohol om nucleïnezuren neer te slaan. Na een korte incubatie wordt het monster opnieuw gecentrifugeerd om het DNA als pellet te verzamelen.

Na het wassen met 70% ethanol om overtollige zouten te verwijderen, wordt de DNA-pellet geresuspendeerd in water of buffer en is deze gereed voor genotypering.

Er zijn veel strategieën om te bepalen of een specifieke DNA-sequentie aanwezig is in uw muizen. De meeste hiervan vereisen dat u eerst de genetische regio van belang amplificeert met behulp van de polymerasekettingreactie, of PCR. Voor meer informatie over het opzetten van PCR kunt u de JoVE Science Education “Guide to PCR” raadplegen.

Eén methode om genotypen te onderscheiden is het detecteren van veranderingen in de grootte van het PCR-geamplificeerde fragment. Stel dat u screent op muizen met een genetische insertie van 700 base pairs. Na PCR zijn de wildtypebanden 200 base pairs, en de transgeenbanden zouden 900 base pairs moeten zijn.

Scheid na het uitvoeren van uw PCR de reactieproducten op een agarosegel met een geschikt percentage, zodat u de groottes van uw fragmenten kunt onderscheiden. De wildtypecontrole mag alleen de wildtypeband van 200 base pairs hebben; de transgene controle mag alleen de ene transgeenband van 900 base pairs hebben; en de het-controle moet beide banden hebben. Ten slotte wordt een “no template”-controle meegenomen om er zeker van te zijn dat de reagentia geen contaminerend DNA bevatten, en er mogen daarom geen banden ontstaan.

Nu we er zeker van zijn dat de controles hebben gewerkt zoals verwacht, bekijken we de onbekende muizen. Aangezien muis 1 en 2 elk slechts één wildtypeband hebben, zijn zij homozygoot wildtype. Muis 4 en 6 hebben elk slechts één transgeenband en zijn daarom homozygoot transgeen.

En muis 3 en 5 hebben elk twee banden en zijn daarom hets.

Wanneer u uiteindelijk teruggaat om de muizen met het gewenste genotype te vinden, hoeft u alleen het patroon van de oorknipjes te koppelen aan het ID-nummer van de muis.

Nadat we inzicht hebben gekregen in wat genotyping is en hoe dit wordt uitgevoerd, bekijken we enkele voorbeelden van waarom dit nuttig is.

In sommige gevallen zijn complexere genetische modificaties vereist om het gewenste fenotype te produceren. Om bijvoorbeeld dit model van huidkanker bij muizen te vestigen, zijn twee transgenen nodig. Eén bevat een induceerbaar "oncogen", ofwel een gen dat kanker kan veroorzaken, en het tweede bevat het enzym Cre-recombinase, dat alleen in huidcellen tot expressie komt en een sequentie exciseert die de transcriptie van het oncogen verhindert, waardoor de expressie van het oncogen mogelijk wordt. Om nakomelingen te produceren met beide transgenen, worden muizen die heterozygoot zijn voor elk van deze genen met elkaar gepaard. Genotyping wordt vervolgens gebruikt om de gewenste nakomelingen te identificeren.

Soms is het niet mogelijk om muizen vóór een experiment te genotyperen. In deze studie naar de embryonale hartslag is het bijvoorbeeld niet haalbaar om weefsel voor genotyping van de embryo's te verzamelen zonder hun gedrag te verstoren. Daarom worden de posities van de embryo's in de moeder eerst zorgvuldig gelabeld, waarna echografische metingen worden geregistreerd. Ten slotte worden staartbiopten verzameld om het effect van het genotype op de hartslag te bepalen.

Deze video heeft één methode voor DNA-extractie gedemonstreerd, maar er zijn veel variaties. Het Direct PCR-systeem vereist bijvoorbeeld minder dan vijf minuten weefseldigestie. Bovendien is, na het centrifugeren van onverteerd materiaal, het supernatant direct klaar voor PCR, waardoor DNA-zuivering overbodig is.

U heeft zojuist JoVE's handleiding voor het genotyperen van muizen bekeken. In deze video hebben we de basisprincipes van de muisgenetica besproken, hoe u DNA-monsters van muizen voorbereidt en analyseert, en enkele praktische toepassingen van deze techniek. Bedankt voor het kijken!