Name: Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Leer intravitale multiphotonmicroscopie voor het in kaart brengen van immuuncelgedrag in de lever van CXCR6.Gfp muizen. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van leukocytenmigratie en interacties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken de Centrale Dierfaciliteit van het Universitair Ziekenhuis Aken voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG Ta434/2-1, DFG SFB/TRR 57) en door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Aken. Dit werk werd verder ondersteund door de Kernfaciliteit ”Two-Photon Imaging”, een Kernfaciliteit van het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) Aken binnen de Faculteit Geneeskunde van de RWTH Aken Universiteit.

OPMERKING: De experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wetgeving inzake dierproeven na de &#39;Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren&#39; (NIH publicatie, 8e editie, 2011) en de Richtlijn 2010/63 / EU betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden (Publicatieblad van de Europese Unie, 2010). Officieel toestemming is verleend uit de gouvernementele dier zorg en gebruik op kantoor (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Duitsland). OPMERKING: Stappen die kan worden weggelaten voor de korte termijn beeldvorming (bv snap shots, 3-D stapels of ook korte duur time-lapse microscopie) zijn gemarkeerd met een sterretje (*) aan voorbereidingstijd te verminderen en de chirurgische protocol te vereenvoudigen. Visualisatie kan ook worden uitgevoerd zonder uitgebreide bewaking en controle circulatie eventueel echter overlevingstijd wordt aanmerkelijk verminderd. 1. Microscoop Setup en Pre-operatie Voorbereiding (5-10 min) <ol><li> Switch systeem op (microscoop, macht Lab, laser, verwarming pad, klimaatkamer, webcam, injectiepomp apparaat, gasmasker). </li><li> Sluit O 2 levering aan Isoflurane Vapor en stel Isoflurane niveau tot 1,5 Vol% (v / v), aan te sluiten op een klein dier gasmasker. <ol><li> Voor de korte termijn beeldvorming, onderhouden van de anesthesie met behulp van isofluraan pas na de eerste ip anesthesie inductie (zie stap 2.2). Maak dan gebruik van 2 Vol% (v / v) Isoflurane, en houden de beeldvorming tijd onder de 2 uur tot stabiele lever microcirculatie garanderen. </li></ol></li><li> Stel ademhaling tot ademhaling 120-140 cycli / min met een volume van 150-200 gl. </li><li> Opgezet muis agarose podium. Maak 100 ml 3% (w / v) agarose, gieten in een schaal (ongeveer 10 cm x 15 cm base) in een hoek van 40 °. </li><li> Opgezet chirurgische werkgebied het verzamelen van de benodigde instrumenten. Om microbiële infectie te voorkomen, desinfecteren instrumenten met een 1% -oplossing van Sekusept Forte S (9,9% w / v) Glutaral 9,8% w / v, Formaldehyde gedurende 5 minuten voor het experiment (figuur 1A). </li><li> Verkrijgen overige bestanddelen: huiddesinfectans (bijvoorbeeld 10% povidon-joodoplossing), lever fase (stacks en bruggen), agarose oplossing (3% (w / v) in PBS), spuitpomp met 5% (w / v) glucoseoplossing (G-5), spuitpomp met anestheticum I (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml), wattenstaafjes, n-butyl-2-Cyanoacrylat en 1x PBS. Zet agarose stadium gerecht in incubatiekamer voor het voorverwarmen. </li></ol> 2. tracheotomie (10-15 min) <ol><li> Gebruik C57BL / 6 muizen uit in het huis van de fokkerij met een gewicht van 25-28 g. Het huis van de muizen onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden in overeenstemming met de FELASA richtlijnen, in een temperatuur- en luchtvochtigheid gecontroleerde omgeving met een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus. Toestaan ​​dat dieren vrije toegang tot standaard muizen dieet (Sniff Standard knaagdierendieet) en water ad libitum. </li><li> Verdoven van de muis door initial intraperitoneale (ip) injectie van 250 ui van anestheticum II (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 1 mg / ml, Buprenorfine 10 ug / ml). <ol><li> * Voor onderhoud tijdens intravitale beeldvorming voortdurend anestheticum I toedienen via continue ip injectie (ketamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml) met een spuit pompinrichting met een stroomsnelheid van 0,2 ml / uur in combinatie met inhalatief isofluraan 0,5 vol% (v / v). </li><li> Controleer reflexen na 5 min (bijv knijpvoet pad met een pincet), ontsmet de huid voor tracheotomie, start de voorbereiding als de muis is in chirurgische tolerant anesthesie staat. </li><li> Solliciteer eye beschermende crème (bv Dexpanthenol 50 mg / g) aan het hoornvlies uitdroogt (Figuur 1B). </li></ol></li><li> Fixeren muis op de voorbereiding tafel bloot buikzijde met plakband voor de extremiteiten; zacht uitrekken hals, fixeren in deze positie, bijv. door middel van een rubberen band verslaafd to de snijtanden. <ol><li> Ontsmet de huid en vacht met behulp van povidonjood-oplossing, door het aanbrengen van een ontsmettingsmiddel met een wattenstaafje. </li></ol></li><li> Voeren initiële huid gesneden (0,5-1 cm lengte) direct onder de kin (figuur 1C) <ol><li> Ontleden bindweefsel tussen de speekselklieren (figuur 1D) voorzichtig. </li><li> Openscheuren spierbuis omliggende luchtpijp (figuur 1E, F) voorzichtig. </li></ol></li><li> Plaats chirurgische draad onder de luchtpijp voor later ventilatiebuis fixatie (figuur 1G). <ol><li> Open luchtpijp met micro-schaar tussen kraakbeen ringen uitvoeren van een T-vormige insnijding (Figuur 1H) </li></ol></li><li> Plaats ventilatiebuis in luchtpijp door de incisie (-0,5 cm). Aan de buis naar voren te duwen, grijpen caudale einde met kleine anatomische pincet en voorzichtig vooruit de buis in de luchtpijp (Figuur 1I) </li><li> Fixeer buis met chirurgische draad (bv </em&gt;, 5-0) met schroefdraad geplaatst in Stap 2.5 koppelverkoop een knoop rond buis in de luchtpijp; presteren tweede craniale fixatie van de buis op de huid om toevallige depositioning (Figuur 1J, K) te vermijden. </li><li> Verbinding gesneden met weefsellijm (bijvoorbeeld n-butyl-2-Cyanoacrylat) (Figuur 1L). </li><li> Fixeer buis op het hoofd met behulp van plakband. </li></ol> 3. laparotomie (15-20 min) <ol><li> Plaats de muis op de verwarming pad om onderkoeling te voorkomen. Scheren buik, verwijder voorzichtig het haar uit de huid. Ontsmet geschoren huid en vacht met behulp van povidonjood-oplossing. </li><li> Voer een kleine huid onder het borstbeen met behulp van chirurgische schaar (Figuur 2A) te snijden. Verleng de snede zijdelings onder de ribben aan beide kanten, alle zichtbare bloedvaten dichtschroeien om het bloeden te voorkomen. </li><li> Voeren voorzichtig een klein sneetje in de linea alba onder het borstbeen, het openen van het buikvlies (Figuur 2B). Verleng de cut om beide kanten met behulp cauterizatie tot bloeden (figuur 2C, D) te voorkomen. </li><li> Plaats de muis in agarose stadium schaal (figuur 2E). Plaats stapels geschikte hoogte aan beide zijden van de muis (meestal 12-14 dekglaasjes) (figuur 2F). </li><li> Plaats respiratoire triggersensor eronder bovenrug om de microscoop met de ademhaling te synchroniseren. Activeer trigger-eenheid (figuur 2G). </li><li> Plaats chirurgische draad (5-0) door het borstbeen ribben (figuur 2I) in te trekken. </li><li> Knip ligament verbinden lever en middenrif (falciform ligament) en lever en het maag-darmkanaal met gekromde chirurgische schaar. Snijd de falciform ligament tot in de aorta (Figuur 2J). </li></ol> 4. Steekproef Setup (10-15 min) <ol><li> Plaats muis naar de rechterkant met een hoek van 45 ° voor gemakkelijke toegang tot grote lever kwab. </li><li> Voeg enscenering brug onder de ribben, die de buikholte. Vervaardigen van een brug met behulp van een standaard dekglas met plakband coating om scherpe randen (figuur 2K) te dekken. </li><li> Plaats grote lever kwab op het podium. Zorgvuldig slip dubbele bal stylus sonde of een gewatteerde spatel onder de lever en houd de bovenkant van het orgel met een nat wattenstaafje of nat weefsel. Til kwab op de glijbaan en zachtjes te slepen. Kwab kan worden gebogen of gevouwen. Voorzie extra zorg slechts zachte manipulatie van de lever (Figuur 2L). </li><li> Plaats laterale ondersteuning staken, bijvoorbeeld stapels kleine dekglaasjes (20 mm x 20 mm), ongeveer dezelfde hoogte van de lever kwab ernaast om dekglas ondersteunen. </li><li> Plaats grote dekglas (24 mm x 50 mm) op de lever kwab. Zorg ervoor dat dekglas is gericht zoveel mogelijk horizontaal (figuur 2M). OPMERKING: Het dekglas moet in contact met het weefsel zonder erin te knijpen. Controleer op zichtbare tekenen van verminderde doorbloeding (wit weefsel). Als Microcircning wordt verstoord, voeg verdere ondersteuning van inzet. </li><li> * Plaats twee onafhankelijke intraperitoneale katheters (Figuur 2 N) voor de lange termijn anesthesie en G-5 toepassing. Installeer katheters zijdelings in de onderbuik naast de achterste ledematen. OPMERKING: De intraperitoneale katheters zelfgemaakte door verbinding 27 G naalden met flexibele siliconen buis (figuur 3) zijn. </li><li> * Fixeer de naald met een lus van 5-0 chirurgische draad aan de huid om onbedoelde verplaatsing te voorkomen. </li><li> * Bevestig de spuit pomp met verdoving oplossing die ik tot katheter 1, ingesteld debiet tot 0,2 ml / uur; hechten spuit pomp met G-5 tot katheter 2, ingesteld debiet tot 0,1 ml / uur. </li></ol> 5. Mouse Monitoring <ol><li> * Plaats ECG-elektroden in de voorste en achterste ledematen (figuur 4A). </li><li> * Bevestig verstrijken slang aan op 2-niveau sensor co. </li><li> Voeg externe temperatuursensor aangesloten op warmte-pad (Figuur 4C). </li></ol> 6. Inbedding en fixatie van het weefsel (5-10 min) <ol><li> Maak 100 ml 3% (w / v) agarosegel in 1 x PBS. Insluiten lever wanneer de temperatuur bij 41 ° C met een 5 ml spuit en een 18 G naald (figuur 5A). </li><li> Giet resterende agarose op dekglaasje en rond de muis (Figuur 5B, C). Wacht tot agarose volledig is ontsloten. </li><li> Verwijder overtollig agarose met de Heidemann spatel bereiden van een Viewfield groot genoeg om de bereide lever kwab (Figuur 5D, E) scannen. </li></ol> 7. Imaging <ol><li> Breng de muis naar microscoop klimaatkamer. </li><li> Voeg 50-100 ml 1x PBS (voorverwarmd op 37 ° C). </li><li> Dek de schaal voor monsters om te voorkomen dat de verdamping (Figuur 5F). </li><li> * Aantal inhalatief isofluraan 0,5 vol% (v / v). </li><li> * Start monitoring software, opname ECG, hartslag en expiratoire CO2. </li><li> Start beeldvorming: openen laser rolluiken, identificeren uitzicht aandachtsgebieden, te definiëren bovenste en onderste grens voor Z-stacks, en start time lapse-opname. Bijstellen Z-stacks zo nodig Z-drift corrigeren (bijv. Als gevolg van veranderingen in bloeddruk of temperatuurschommeling figuur (5G). OPMERKING: Na voltooiing van de beeldvormende periode of wanneer de circulatie of verdoving van de dieren instabiel, offeren muizen door cervicale dislocatie (zonder ontwaken uit de anesthesie). </li></ol>

<ol><li>Dusseaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+MAIT+cells+are+xenobiotic-resistant%2C+tissue-targeted%2C+CD161hi+IL-17-secreting+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells.</a> Blood. 117 (4), 1250-1259 (2011).</li>
<li>Reese, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hypoxia+on+liver+secretion+studied+by+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy.</a> Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).</li>
<li>Bhathal, P. S., Christie, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+study+of+bile+ductule+proliferation+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs.</a> Gut. 10 (11), 955(1969).</li>
<li>Stefenelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+vascular+system+and+microcirculation+of+the+rat+liver+in+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Wien+Klin+Wochenschr%22%5BJournal%5D)">Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy.</a> Wien Klin Wochenschr. 82 (33), 575-578 (1970).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+sure+methodology+for+massive+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse.</a> Ann Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+dual-colored+visualization+of+colorectal+liver+metastasis+in+living+mice+using+two+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 307-315 (2011).</li>
<li>Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reperfusion+injury+is+dramatically+increased+by+gentle+liver+manipulation+during+harvest%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Int%22%5BJournal%5D)">Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest.</a> Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).</li>
<li>Schemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+Kupffer+cells+cause+a+hypermetabolic+state+after+gentle+in+situ+manipulation+of+liver+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280 (6), G1076-G1082 (2001).</li>
<li>Toiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+DSS-induced+cecal+mucosal+damage+in+GFP-transgenic+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy.</a> J Gastroenterol. 45 (5), 544-553 (2010).</li>
<li>Zimmon, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hepatic+vasculature+and+its+response+to+hepatic+injury%3A+a+working+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Yale+J+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis.</a> Yale J Biol Med. 50 (5), 497-506 (1977).</li>
<li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> J Clin Invest. 99 (11), 2782-2790 (1997).</li>
<li>Bonder, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+neutrophil+recruitment+to+the+liver+in+concanavalin+A-induced+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis.</a> J Immunol. 172 (1), 45-53 (2004).</li>
<li>Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence+excitation%3A+new+spectral+windows+for+biological+nonlinear+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20), 10763-10768 (1996).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys J. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Amore, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multiphoton+imaging+of+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+reveals+marked+thioflavine-S-associated+alterations+in+neurite+trajectories%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 62 (2), 137-145 (2003).</li>
<li>Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+inflammatory+leukocyte+recruitment+in+kidney%2C+lung+and+liver--challenges+to+the+multi-step+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm.</a> Immunol Cell Biol. 91 (4), 281-289 (2013).</li>
<li>McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+specifically+associated+with+thioflavine+S-positive+amyloid+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy.</a> J Neurosci. 23 (6), 2212-2217 (2003).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+Immune+Surveillance+by+CXCR6%2B+NKT+Cells+Patrolling+Liver+Sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids.</a> PLoS Biology. 3 (4), (2005).</li>
<li>Velázquez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+activation+by+innate+cytokines+or+microbial+antigens+can+cause+arrest+of+natural+killer+T+cell+patrolling+of+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids.</a> J Immunol. 180 (4), 2024-2028 (2008).</li>
<li>Wehr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR6-dependent+hepatic+NK+T+Cell+accumulation+promotes+inflammation+and+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis.</a> J Immunol. 190 (10), 5226-5236 (2013).</li>
<li>Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+contribute+to+postischemic+liver+injury+in+mice+by+interacting+with+sinusoidal+endothelium+and+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets.</a> Hepatology. 43 (2), 306-315 (2006).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+T+cell+dynamics+during+the+development+and+disintegration+of+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+donovani-induced+expression+of+signal+regulatory+protein+alpha+on+Kupffer+cells+enhances+hepatic+invariant+NKT-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation.</a> Eur J Immunol. 40 (1), 117-123 (2010).</li>
<li>Beattie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+experimental+Leishmania+donovani-induced+hepatic+granulomas+detects+Kupffer+cell-restricted+antigen+presentation+to+antigen-specific+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells.</a> PLoS Pathog. 6 (3), e1000805(2010).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330 (6002), 362-366 (2010).</li>
<li>Vanheule, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intravital+microscopic+study+of+the+hepatic+microcirculation+in+cirrhotic+mice+models%3A+relationship+between+fibrosis+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis.</a> Int J Exp Pathol. 89 (6), 419-432 (2008).</li>
<li>Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+surveillance+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune surveillance by the liver.</a> Nat Immunol. 14 (10), 996-1006 (2013).</li>
<li>Zimmermann, H. W., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+chemokine+pathways+and+immune+cell+infiltration+as+a+novel+therapeutic+approach+in+liver+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10 (6), 509-536 (2011).</li>
<li>Kim, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+microscopy+imaging+of+intact+spinal+cord+and+cerebral+cortex+reveals+requirement+for+CXCR6+and+neuroinflammation+in+immune+cell+infiltration+of+cortical+injury+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites.</a> J Immunol Methods. 352 (1-2), 89-100 (2010).</li>
<li>Karlmark, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+recruitment+of+the+inflammatory+Gr1%2B+monocyte+subset+upon+liver+injury+promotes+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis.</a> Hepatology. 50 (1), 261-274 (2009).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+macrophage+migration+and+differentiation+critical+for+liver+fibrosis+is+mediated+by+the+chemokine+receptor+C-C+motif+chemokine+receptor+8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice.</a> Hepatology. 55 (3), 898-909 (2012).</li>
<li>Ramachandran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Ly-6C+expression+identifies+the+recruited+macrophage+phenotype%2C+which+orchestrates+the+regression+of+murine+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), E3186-E3195 (2012).</li>
<li>Moles, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TLR2%2FS100A9%2FCXCL-2+signaling+network+is+necessary+for+neutrophil+recruitment+in+acute+and+chronic+liver+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse.</a> J Hepatol. 60 (4), 782-791 (2014).</li>
<li>Hammerich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CCR6-dependent+accumulation+of+%CE%B3%CE%B4+T+cells+in+injured+liver+restricts+hepatic+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis.</a> Hepatology. 59 (2), 630-642 (2014).</li>
<li>Syn, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT-associated+hedgehog+and+osteopontin+drive+fibrogenesis+in+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease.</a> Gut. 61 (9), 1323-1329 (2012).</li>
<li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+CD44+and+hyaluronan+is+the+dominant+mechanism+for+neutrophil+sequestration+in+inflamed+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids.</a> J Exp Med. 205 (4), 915-927 (2008).</li>
<li>Egen, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+limited+antigen+presentation+and+T+cell+effector+function+in+mycobacterial+granulomas%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas.</a> Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).</li>
<li>Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+microcirculation+in+murine+sepsis%3A+role+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Surg+Int%22%5BJournal%5D)">Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes.</a> Pediatr Surg Int. 24 (1), 13-20 (2008).</li>
<li>Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+in+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The neutrophil in vascular inflammation.</a> Nat Med. 17 (11), 1381-1390 (2011).</li>
<li>Khandoga, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS One. 4 (3), e4693(2009).</li>
</ol>

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Het doel van onze studie was een zeer gestandaardiseerde, stabiele en reproduceerbare werkwijze voor intravitale TPLSM beeldvorming van de lever ontwikkelen. Intravitale beeldvorming in het algemeen heeft waardevolle inzichten in cellulaire gedrag onder real life omstandigheden volgende homing en interactie van verschillende leukocyten bevolkingsgroepen in ontwikkeling, homeostase en ziekte gegeven. De bosweg anatomische positie van de lever, waardoor respiratoire en intestinale peristaltische beweging direct worden doo...

De visualisatie van cellen en cellulaire functies geheel organen of zelfs hele organismen is van groot belang voor meer dan 50 jaar, waaronder vrijwel alle delen van het lichaam 2. Daarom zijn sommige vroege studies reeds in dienst intravitale beeldvorming van de lever 3,4. Echter, een aantal beperkingen bestaan ​​op de hoogte over de lange termijn een stabiele hoge-resolutie beeldvorming van leverweefsel. Door de anatomische positie van de lever in nauw contact met het membraan en het maagdarmkanaal 5, het meest voorkomende probleem voor microscopische beeldvorming intravitale beweging door ademhaling en, in mindere mate, peristaltische van het darmkanaal 6. In vergelijking met andere vaste organen, lever chirurgie is een bijzondere uitdaging. Vanwege de dichte microvasculaire structuur, kan chirurgische manipulatie leiden tot massale hemorragische laesies, verminderde microcirculatie 7 en ook de activering van de ingezeten immune cellen zoals Kupffercellen 8. Daarom mechanische fixatie van het weefsel zoals elders gepubliceerd 6,9 waarschijnlijk interfereren met het opklaren beeldvorming. In een gezonde lever, 10-15% van het totale bloedvolume bevindt in de lever vaatstelsel en het orgaan ontvangt ongeveer 25% van de totale hartminuutvolume 10, waardoor het orgaan zeer gevoelig voor veranderingen in de bloedsomloop (bijv bloeddrukschommelingen ). Daarom zal storingen in de doorbloeding van de lever als gevolg van bv, shear stress, verplaatsing, verwondingen door overmatige weefsel behandeling of gecentraliseerde circulatie leiden tot kunstmatige veranderingen in leukocyten trekgedrag, verminderde lever- zuurstofvoorziening en daarom verdere beschadiging van de lever, waardoor de lever immuunreacties alsook als orgaanpreservatie en totale levensduur van het dier. Vroege microscopisch werden gebaseerd op intravitale epifluorescentie microscopy, maar een aantal technische beperkingen, zoals foto bleken en indringdiepte laag beperk het gebruik van deze techniek voor de lange termijn lever beeldvorming 4,11,12. Met de ontwikkeling van multifoton microscopie in de jaren 1990 werden de beperkingen van foto bleken of indringdiepte hoofdzakelijk opgelost omdat deze nieuwe methode technisch staat om imaging studies uitgevoerd in vrijwel alle organen in reële situaties 13-15. De belangrijkste resterende problemen inzake leverbeeldvorming waren: ademhaling bewegingen, autofluorescentie van leverweefsel, vastzetten ongewijzigd bloedstroom in de lever sinusoïden, en vooral stabiele beeldvorming voor langere perioden van enkele hr 16. Hoewel verschillende studies ingegaan op de functie en de migratie van diverse leukocyten in de lever 17, bijvoorbeeld, NKT-cellen 18-20, T-cellen 21,22, lever macrofagen 23,24 of neutrofielen 25, op lange termijn multifoton microscopy imaging nog niet tot stand is gebracht, een taak nog moeilijker bij dieren met acute of chronische leverziekte door de bestaande schade en derhalve hogere gevoeligheid voor verdere schade 26. Echter, monitoring trekgedrag en cellulaire functie van leukocyten in de lever in real time mogelijk maakt nieuwe inzichten in hun specifieke rol in de lever homeostase en ziekte 27. De chemokine receptor CXCR6 wordt uitgedrukt op verschillende lymfocyten en natuurlijke killer (NK) cellen, NKT-cellen en een aantal T-celpopulaties 18,28. Voorafgaande studies bij muizen hebben aangetoond dat CXCR6 en zijn verwante ligand CXCL16 het patrouilleren van NKT cellen kunnen controleren op de lever sinusoïden tijdens homeostase. Bijgevolg heeft het gebruik van CXCR6.gfp muizen (die een knock-in groen fluorescerend eiwit [gfp] in de CXCR6 locus) beschreven de migratie van lymfocyten onderzocht in diverse organen zoals hersenen 29alsmede lever 18,20, met verhoogde infiltratie van CXCR6.gfp cellen na ontsteking. Met de in deze studie methode was het mogelijk deze processen gedurende een lange periode onder stabiele omstandigheden te volgen. De intravitale multifoton gebaseerde procedure toegestaan ​​beeldvorming die zeer reproduceerbaar met minimale verstoring van het dier en het orgel was; geoptimaliseerd voor de lange termijn dier overleven door een uitgebreide controle, gevolgd door een nauwgezette controle van de ademhaling en de bloedsomloop; en zeer flexibel en gemakkelijk te nemen ook andere parenchymale organen zoals nieren en milt.

<table><tbody><tr><td>Anesthetics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0.1 mg/kg</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Rotex Medica</td><td>charge: 30819</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac-anesthesiesysteem</td><td>Harvard Apparatus</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>Glucose 5%</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Isoflurane Vapor) verdamper</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Isotone (0,9%) NaCl-oplossing</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>ceva</td><td>Charge: 36217/09</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin 2%</td><td>medistar</td><td>Charge: 04-03-9338/23</td><td></td></tr><tr><td>Verbruiksartikelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml spuit</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyerkolf</td><td>Schott Duran</td><td>21 226 36</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Beker 2x</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>2 ml spuit</td><td>BD Plastipak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl-naald</td><td>Ethicon</td><td>V7980</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Commercieel verkrijgbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen oog- en neuszalf</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>18010-00</td><td></td></tr><tr><td>Gaasjes</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas 24x50 mm</td><td>ROTH</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>Durapore-zijdetape</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Feather wegwerp-scalpel</td><td>Feather</td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>Fine Bore Polyethyleenbuis 0,58 mm ID</td><td>Smiths medical</td><td>800/100/200</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun</td><td>1050052</td><td>5x 0,5 ml</td></tr><tr><td>Leukoplast</td><td>BSN Medical Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopenglazen</td><td>ROTH</td><td>1879</td><td></td></tr><tr><td>Poly-alcohol Haut&hellip;farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Sterican-naald 18 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Sterican-naald 27 3/4 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Weefselpapier</td><td>Commercieel verkrijgbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische instrumenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amalgaam polijstmachine 3PL</td><td>Gatz</td><td>0110?</td><td></td></tr><tr><td>Blair retractoren (4-taks (bot)) x2</td><td>Storz&amp;Klein</td><td>S-01134</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr.7 pincet</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Graefe pincet gebogen x1</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Graefe pincet recht x2</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Heidemann spatel HD2</td><td>Stoma</td><td>2030.00</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhaakjes Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Semken pincet</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische schaar gebogen</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14029-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische schaar recht</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Standaard pincet</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas veerscharen</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECG-triggereenheid</td><td>Rapid Biomedical</td><td>3000003686</td><td></td></tr><tr><td>MICROCAPSTAR eind-expiratoire koolstofdioxide-analysator</td><td>AD Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minivent Typ 845</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Multifoton-microscoop Trimscope I</td><td>LaVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfusor Compact</td><td>B. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 8-kanaals recorder</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurgeregeld verwarmingskussen</td><td>Sygonix</td><td>26857617</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuursensor</td><td>Commercieel verkrijgbaar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurgeregeld systeem voor microscopen -Cube&amp;Box</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

long term intravitale multiphoton microscopie beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp cxcr6.gfp reporter muizen

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

<html> Lever ontsteking als reactie op letsel is een zeer dynamisch proces dat de infiltratie van verschillende subtypen van leukocyten, waaronder monocyten, neutrofielen, T-cel subsets, B-cellen, natuurlijke killer (NK) en NKT cellen. Intravitale microscopie van de lever toezicht immuun celmigratie is een bijzondere uitdaging vanwege de hoge eisen met betrekking monstervoorbereiding en fixatie, optische resolutie en langdurige dieroverleving. Toch kon de dynamiek van inflammatoire processen, alsmede cellulaire interactie onderzoeken kritische informatie om beter te begrijpen de initiatie, progressie en regressie van inflammatoire leverziekte bieden. Daarom werd een zeer gevoelige en betrouwbare methode vastgesteld migratie en cel-cel-interacties van andere immuuncellen in muizenlever gedurende lange perioden (ongeveer 6 uur) door intravitale twee-foton laser scanning microscopie (TPLSM) studie in combinatie met intensive care monitoring. ent &quot;&gt; Werkwijze ontvangen omvat een zachte preparaat en stabiele fixatie van de lever met minimale verstoring van het orgaan en lange termijn intravitale beeldvorming met multicolor multifoton microscopie met vrijwel geen fotobleken en fototoxische effecten gedurende een periode van maximaal 6 uur, waardoor volgen van specifieke leukocyten subsets en stabiele beeldvorming omstandigheden te wijten aan een uitgebreide controle van de muis vitale parameters en stabilisatie van het verkeer, de temperatuur en de gasuitwisseling. Om lymfocytenmigratie op leverontsteking onderzoeken CXCR6.gfp knock-in muizen werden onderworpen aan intravitale leverbeeldvorming onder basisomstandigheden en na acute en chronische leverschade geïnduceerd door intraperitoneale injectie (s) van koolstoftetrachloride (CCl4). CXCR6 is een chemokine receptor expressie op lymfocyten, voornamelijk Killer Natural T (NKT) -, Natural Killer (NK) - en subsets van T-lymfocyten zoals CD4 T-cellen maar ook mucosale Associated invariante (MAIT) T-cellen 1. Naar aanleiding van de trekkende patroon en de positionering van CXCR6.gfp + immuuncellen toegestaan ​​een gedetailleerd inzicht in hun veranderde gedrag op leverschade en dus hun mogelijke betrokkenheid bij progressie van de ziekte.

Om onze intravitale TPLSM benadering te valideren, we onderworpen CXCR6 GFP / + muizen om intravitale TPLSM beeldvorming. Muizen werden ofwel onbehandeld als basislijn controles of onderworpen aan een enkele intraperitoneale injectie van tetrachloorkoolstof (CCl 4) om acute leverschade 20 induceren. Video sequenties werden genomen over een periode van 2-5 uur, en cellen werden getraceerd tijd vanwege hun groene fluorescentie. Om algemene cellulaire beweeglijk...

Het is een uitdaging om stabiele, intravitale, hoogwaardige beelden van immuuncellen in de lever te maken. Hier bieden we een zeer gevoelige en betrouwbare methode om migratie en cel-cel-interacties van immuuncellen in de muizenlever gedurende langere perioden (ongeveer 6 uur) te bestuderen door middel van intravitale multifoton laser scanning microscopie in combinatie met intensieve zorg monitoring.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de migratie en interactie van leukocyten in progressieve leverontstekingsziekten te volgen. Dit dient om beter inzicht te krijgen in de opeenvolging van gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan de manier waarop deze cellen in het leverweefsel worden gerekruteerd en hun potentiële betrokkenheid bij de immunopathologie. Dit wordt bereikt door eerst een tracheotomie uit te voeren om controle over de ademhaling van de muis te krijgen, een cruciale stap om het langetermijnoverleven van het dier te garanderen.Als tweede stap wordt er een laparotomie bij de muis uitgevoerd om de lever chirurgisch bloot te leggen, waardoor het orgaan toegankelijk wordt voor de multifotonmicroscoop. Vervolgens wordt de lever gefixeerd en gepositioneerd door deze in een roos in te bedden om bewegingsartefacten te minimaliseren. Beeldvorming kan gedurende enkele uren worden uitgevoerd, wat leidt tot tijdversnelde sequenties met een hoge resolutie die de veranderingen in rekrutering, positionering en interactie van individuele leukocyten volgen.Bij het proces van de ontwikkeling van leverontstekingen kan deze methode helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van acute en chronische leverontstekingen, zoals de rekrutering van leukocyten, cel-celinteracties of mechanismen van immunopathologie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van conventionele microscopie is dat multifocale microscopie langetermijnbeeldvorming mogelijk maakt met vrijwel geen verstoring van het monster, een lage fotobleking of fototoxiciteit, evenals optische coupes tot 100 µm diep in het weefsel; dit is te danken aan de unieke fysica van het laserlicht in het verre rode spectrum. Deze methode kan derhalve inzicht bieden in leverziekten.Het kan eenvoudig worden aangepast aan andere systemen. Dankzij de methode van stabilisatie en fixatie kan het weefsel worden toegepast op vrijwel alle vraagstukken van intravitale microscopie, waardoor organen zoals de milt, nieren of zelfs subcutane tumoren eenvoudig kunnen worden afgebeeld met behulp van fluorescente gerelateerde cellen. Het is tevens mogelijk om alle leukocyten-subsets te visualiseren en hun interacties bij leverontstekingen in kaart te brengen.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben vanwege de extreme complexiteit van chirurgie bij kleine dieren. Echter, op basis van onze eigen ervaring is dit slechts enkele weken een beperkende factor en is er enkel wat praktische routine nodig. Vanwege de fragiliteit van leverweefsel zijn de voorbereidende stappen moeilijk aan te leren en is een visuele demonstratie van de methode essentieel. Vul, na het opzetten van de anesthetica, de muizenpodia met 3%aros door dit onder een hoek van 40 graden in te gieten.Zorg vervolgens dat het chirurgische werkgebied volledig is gedesinfecteerd, evenals alle benodigde instrumenten en dergelijke. Anestheseer de muis daarna met een intraperitoneale injectie van een anesthetisch cocktail. Controleer vijf minuten later de reflexen van het dier, desinfecteer vervolgens de huid en breng oogzalf aan op de ogen.Zet de muis nu vast op de preparatietafel. Positioneer de muis met behulp van plakband zodanig dat de ventrale zijde blootligt, waarbij de nek voorzichtig wordt overstrekt. Dit kan worden bereikt door een elastiekje aan de snijtanden te bevestigen.Maak nu de initiële incisie onder de kin van ongeveer 0,5 tot één centimeter lang. Disseceer vervolgens voorzichtig het bindweefsel tussen de speekselklieren en zoek de spierbuis die de trachea omringt. Scheur de spier voorzichtig open om de trachea bloot te leggen.Trek een draad onder de trachea door, open vervolgens de trachea met microschaar door middel van een T-vormige incisie in de bestaande incisie. Voer de ventilatiebuis ongeveer een halve centimeter in. Schuif de buis verder op met kleine anatomische pincetten.Zet de tube vervolgens vast met hechtingen. Hecht de tube daarna voor extra zekerheid aan de huid, sluit de incisie in de huid af met cyanoacrylaat en bevestig de tube aan de kop van het dier. Handhaaf de anesthesie met behulp van plakband door een continue stroom van 2% isofluoraan.Nadat de muis voor de operatie is voorbereid, wordt er een kleine huidincisie onder het sternum gemaakt, die zijwaarts onder de ribben aan beide kanten wordt uitgebreid. Cauteriseer tijdens dit proces alle blootliggende bloedvaten. Om bloedingen te minimaliseren, wordt er een kleine initiële snede bij de linea alba gemaakt om toegang te krijgen tot de buikholte.Verbreed de incisie horizontaal, waarbij alle bloedvaten worden afgesloten om toegang tot de lever te verkrijgen. Plaats de muis nu op de agro-tafel en stapel aan weerszijden van het dier glaasjes om het op zijn plaats te houden. Deze stapels moeten overeenkomen met de hoogte van de muis, zodat de tafel voor de lever, die later wordt geplaatst, geen overmatige druk op de buikholte uitoefent.Retract nu de ribben met behulp van hechtingen in het borstbeen. Een 4-0 hechtdraad is hiervoor voldoende. Nadat de ribben zijn geretracteerd, worden de ligamenten die de lever en het diafragma verbinden doorgeknipt; knip helemaal door tot aan de aorta, maar werk met extra voorzichtigheid om te voorkomen dat het vat scheurt of wordt doorgesneden. Knip daarnaast het ligament door dat de lever met het maagdarmstelsel verbindt.Draai de muis 45 graden om de toegang tot de grootste leverkwab te verbeteren. Neem een standaard dekglas en plak de randen af zodat deze niet scherp zijn. Plaats dit over de buikholte.Dit zal dienen als een platform om de lever op te positioneren. Schuif voorzichtig een dubbele kogelstylus-sonde of een gewattelede spatel onder de lever en houd de bovenkant van het orgaan vast. Omdat mechanische druk met een vochtig weefselletje het leverweefsel onmiddellijk kan beschadigen, is het essentieel om het orgaan met zorg te behandelen.Til de lob vervolgens op op het objectglas en trek deze voorzichtig in de juiste positie. De lob zal meestal gebogen of gevouwen eindigen; probeer de randen voorzichtig uit te vouwen door het weefsel op te tillen met een dunne spatel of een vochtig tissue. Voeg daarna zijwaartse steunen toe in de vorm van dekglasjes of objectglazen.Stapel de dekglasjes zodanig dat ze dezelfde hoogte hebben als de leverkwab. De positionering en fixatie van de lever is de meest cruciale stap in het protocol. Elke mechanische stress, torsie of druk zal leiden tot onmiddellijke weefselschade of ten minste een belemmerde bloedstroom in de sinusoïdale vaten.Plaats nu een groot dekglas met afgeplakte randen over de leverkwab, ondersteund door de laterale steunen. Positioneer dit dekglas zo waterpas mogelijk. Het mag de lever niet samenknijpen.Wit weefsel duidt op een verminderde doorbloeding, tenzij de beeldvorming snel wordt uitgevoerd. Het is nu noodzakelijk om twee onafhankelijke intraperitoneale katheters in te brengen voor langdurige anesthesie en het toedienen van G five. Deze worden samengesteld uit naalden van 27 gauge en flexibele siliconen buisjes.Start vervolgens de vloeistofstroom met behulp van spuitpompen. Voer de katheters in de onderbuik in, nabij de achterpoten. Nadat de vitale functiemonitors bij de muis zijn aangebracht, bereid je 100 milliliters van 3%aros in één XPBS voor.Wanneer de aros is afgekoeld tot 41 °C, wordt de lever erin ingebed met behulp van een spuit van 5 mL met een naald van 18 gauge. Zodra de aeros is afgekoeld, wordt een heideman-spatel gebruikt om het teveel te verwijderen en een gezichtsveld vrij te maken dat groot genoeg is om de lever te scannen. Ga vervolgens verder met het scannen.Nadat het gezichtsveld is voorbereid, wordt de muis onder de microscoop verplaatst om geschikte scangebieden voor de time-lapse imaging te selecteren. Het leverweefsel wordt visueel gescand met behulp van een externe witte lichtbron om representatieve velden te identificeren met voldoende bloedstroom en minimale verstoring van het monster. CXCR6 GFP heterozygotische muizen werden als experiment onderworpen aan intravitale T-P-L-S-M imaging. Sommigen kregen een intraperitoneale injectie van tetrachloride om acute leverschade op te wekken.Modale cellen die GFP tot expressie brachten, werden gevolgd via video en hun trajecten werden over elkaar heen gelegd om een momentopname van de cellulaire mobiliteit te verkrijgen. De trajecten werden vervolgens genormaliseerd. Normale levers bevatten cellen met willekeurige migratiepatronen.Levermet coursework geïnjecteerd met CCI vier vertoonden een verminderde cellulaire migratie. Bij het meten van de totale verplaatsing vanaf hun oorsprong was duidelijk dat er 36 uur na de CCI vier-behandeling sprake was van celopsluiting op de plaats van de hepatocellulaire schade. De door leverschade belemmerde migratie kon ook worden aangetoond door de migratiesnelheid van individuele cellen over de tijd uit te zetten, waarbij een gedeeltelijke stop na 18 uur en een volledige migratiestop na 36 uur zichtbaar was.De afname in de snelheid van de migrerende cellen kon ook als statistisch significant worden aangetoond wanneer de cellen als populaties werden vergeleken. Deze benadering is derhalve geschikt voor het volgen van veranderingen in celmigratie en positionering bij ontwikkelende leverziekten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de lever van een muis klaarmaakt voor intravitale multifotonmicroscopie.De methode die wij hier presenteren, stelt ons in staat om het dier te stabiliseren voor overleving op lange termijn, terwijl bewegingsartefacten tot een minimum worden beperkt dankzij de milde fixatiemethode die wij beschrijven. Zodra de maskering is voltooid, kan deze techniek in ongeveer één uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt toegepast. Tijdens deze procedure is het essentieel om de vitale parameters van de dieren te controleren, waaronder de stabilisatietemperatuur, hartslag, zuurstofgehalte en CO2-waarden. Dit kan worden bereikt door de diepte van de narcose en de ademhaling bij het volgen van deze techniek aan te passen.Andere procedures, zoals flowcytometrie-analyse of laser-capture microdissectie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het fenotype van de infiltrerende immuuncellen of mediatoren die door weefsel of infiltrerende cellen na hun ontwikkeling worden uitgescheiden. Deze technieken stelden onderzoekers in staat om inzicht te krijgen in de dynamiek van leukocytenverkeer en cellulaire interacties in de lever, waardoor de volgorde van gebeurtenissen die leiden tot inflammatoire leverziekten kon worden ontleed. Volg de richtlijnen voor laserveiligheid bij het uitvoeren van beeldvorming met een infraroodlaser met hoge energiepulsen die wordt gebruikt voor multifotonmicroscopie.Zorg ervoor dat geen enkele reflectie van laserstraling een gevaar kan vormen voor uw ogen en huid tijdens het uitvoeren van dit experiment.

long-term-intravital-multiphoton-microscopy-imaging-immune-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

We beschrijven een methode voor het herhaaldelijk het visualiseren van muriene microglia en circulerende...

Een dunne-schedel Window Techniek voor chronische Twee-foton In vivo Imaging Murine Microglia in modellen van ontstekingsprocessen

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode voor de dynamische meting en kwantificering van bloedstroomsnelheid binnen individuele bloedvaten van de muizenlevervaten met behulp van intravitale microscopie-beeldvorming in combinatie met een specifieke methodologie voor beeldverwerving en analyse.

Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende<em&gt; Leishmania</em&gt; Infectie: een beoordeling van de lever Hemodynamica

Microglia-activatie en microgliose zijn de belangrijkste reacties op chronische neurodegeneratie. Hier presenteren we werkwijzen voor in vivo visualisatietechnieken retinale CX3CR1-GFP + cellen door microgliale confocale Ophthalmoscopie, en drempel en morfometrische analyses worden geïdentificeerd en gekwantificeerd hun activering. We monitoren microglia veranderingen tijdens de vroege stadia van leeftijdsgebonden glaucoom.

In Vivo Dynamiek van retinale Microgliale Activering Tijdens Neurodegeneratie: Confocal oftalmoscopisch Imaging en Cell Morphometry in Mouse Glaucoom

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

We een nieuwe chirurgische protocol voor twee-foton beeldvorming van levende muizen lever met minimale invasie opgericht. Met deze techniek vastgesteld we de gedetailleerde structuur van de lever tijdens lipopolysaccharide-geïnduceerde endotoxemia. Wij verwachten dat deze methode kan worden gebruikt om te bepalen van de effectiviteit van verschillende behandeling van de reagentia te hepatische migratie.

Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever

In dit experiment wordt een muis in zijn staartader geïnjecteerd met Rhodamine B isothiocyanaat-dextran die bloedvaten kan bevlekken. Nadat de lever is blootgesteld en gefixeerd, kan een specifiek deel van de lever worden geselecteerd om het diepe weefsel in het levende lichaam te observeren met behulp van multifotonenmicroscopie.

Multifotonen microscopische observatie van vaten in leverweefsel van muizen

Dit protocol beschrijft een chronische craniale venster implantatie techniek die kan worden gebruikt voor longitudinale beeldvorming van neuro-glio-vasculaire structuren, interacties, en functie in zowel gezonde als zieke omstandigheden. Het dient als een aanvullend alternatief voor de transcraniële beeldvormingsbenadering die, hoewel vaak de voorkeur, een aantal kritische beperkingen bezit.

Nauwkeurige brain mapping om repetitieve in vivo beeldvorming van neuro-immuundynamica in muizen uit te voeren

Hier wordt een benadering gepresenteerd voor intravitale beeldvorming op lange termijn met behulp van optisch heldere, siliconen vensters die rechtstreeks op het weefsel / orgaan van belang en de huid kunnen worden gelijmd. Deze ramen zijn goedkoper en veelzijdiger dan andere die momenteel in het veld worden gebruikt, en de chirurgische inbrenging veroorzaakt beperkte ontsteking en leed voor de dieren.

Longitudinale intravitale beeldvorming door heldere siliconenvensters

Hier beschrijven we een platform dat niet-invasieve in vivo beeldvorming mogelijk maakt van leversferoïden die zijn geënt in de voorste oogkamer van het oog van de muis. De workflow strekt zich uit van het genereren van sferoïden van primaire levercellen tot transplantatie in het oog van de muis en in vivo beeldvorming met cellulaire resolutie door confocale microscopie.

In vivo beeldvorming van leversferoïden geënt in de voorste oogkamer van het muizenoog

Hier presenteren we een protocol om de getransplanteerde linkerlong van de muis intravitaal in beeld te brengen met behulp van twee-fotonmicroscopie. Dit is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamiek en interacties in real-time na longtransplantatie bij muizen.

Intravitale twee-fotonmicroscopie van de getransplanteerde muizenlong

Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om de morfologie van leverstellate cellen in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. Deze benadering combineert fluorescerende labeling van fibroblasten met behulp van muisgenetica, in situ leverperfusie-gebaseerde weefselvoorbereiding en een aangepaste iDISCO-weefselreinigingsmethode om optische transparantie te bereiken.

Mapping van de morfologie van hepatische stellate cellen in muismodellen van leverfibrose

Leer intravitale multiphotonmicroscopie voor het in kaart brengen van immuuncelgedrag in de lever van CXCR6.Gfp muizen. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van leukocytenmigratie en interacties mogelijk.

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen (Video) | JoVE Journal

Long Term intravitale Multiphoton Microscopie Beeldvorming van immuuncellen in gezonde en zieke lever behulp CXCR6.Gfp Reporter Muizen

Meer video's verkennen